一种多能性黄素依赖型色氨酸卤化酶ChlH的发现及其在肽类生物催化中的应用潜力

这篇研究揭示了黄素依赖型卤化酶(Flavin-Dependent Halogenase, FDH) ChlH的独特底物广谱性，该酶能够在线性肽链内部、N端和C端色氨酸(Trp)残基上进行选择性卤化修饰。通过体外重组实验和分子动力学(MD)模拟，研究团队阐明了ChlH不依赖前导肽(leader peptide)的催化特性，并成功将其应用于多种核糖体合成翻译后修饰肽(RiPPs)、药理活性肽段乃至蛋白质底物的修饰。这项工作为生物催化生产卤代肽类药物提供了新型工具酶，其突破性的底物宽容性为蛋白质工程改造奠定了重要基础。

　　

多能性色氨酸卤化酶ChlH的催化特性与生物应用

引言

天然产物在药物开发史上始终占据重要地位，其中卤化修饰是优化生物活性的常见策略。尽管卤代药物在临床应用中广泛存在，但传统氨基酸修饰酶常受限于狭窄的底物范围和复杂的辅助因子需求。黄素依赖型卤化酶(FDHs)在色氨酸(Trp)修饰中扮演关键角色，但已知肽类修饰FDHs通常仅作用于特定修饰肽或线性肽末端。来自氯拉辛生物合成基因簇的ChlH酶，展现出与众不同的底物宽容性。

ChlH酶的功能表征

研究团队成功在大肠杆菌中重组表达了带有His₆标签的ChlH及其辅酶还原酶ChlR。体外实验证实，ChlH特异性地作用于线性前体肽ChlA而非成熟折叠的套索肽des-氯拉辛。质谱分析显示，ChlH能在2小时内完成ChlA上Trp8和Trp12的双氯代修饰，而Trp14的修饰需延长至24小时才可检测。关键催化残基Lys139的突变(K139A)完全消除了卤化活性，证实了经典FDHs的催化机制。

底物特异性研究

通过系统性的丙氨酸扫描和色氨酸扫描突变，发现ChlH对ChlA核心区多数位点的突变具有良好耐受性。特别值得注意的是，位于(-1)位的亮氨酸(Leu)会显著抑制相邻色氨酸的卤化效率，这通过P7L/A11L双突变实验得到验证。分子动力学模拟揭示，ChlH通过C端基序(Leu13-Trp14)识别底物，其中Arg430与Asp15的静电相互作用对底物稳定起辅助作用。

底物广谱性验证

ChlH展现出惊人的底物宽容性，能高效修饰多种非天然底物：

1. 1.

   其他套索肽前体：如FusA_core和DarA-Q8*

2. 2.

   大环肽类：包括含中央吡啶结构的吡啶肽A1

3. 3.

   药理活性肽：如生长激素释放肽GHRP-6及其类似物

4. 4.

   蛋白质底物：在1054个氨基酸的MBP-TbtG融合蛋白中特异性修饰Trp471

细胞快速筛选平台

建立基于无细胞转录翻译系统的高通量筛选方法，构建包含120个变体的突变库。结果显示：

• •

  24%变体可实现双氯代修饰

• •

  小分子疏水残基在(-1)位最有利

• •

  带正电荷残基普遍抑制卤化反应

  该方法成功指导了GLP-1_7-36类似物的工程改造，使其Trp25卤化效率显著提升。

讨论与展望

与已知肽类修饰FDHs相比，ChlH具有三大独特优势：

1. 1.

   不依赖前导肽识别

2. 2.

   可修饰肽链内部Trp

3. 3.

   兼具氯化和溴化活性

   其相对紧凑的活性腔(442 ?³)可能解释了与套索肽修饰酶MibH的底物偏好差异。虽然Trp14在天然产物中未被修饰，但体外实验证实这主要受相邻Leu13的立体阻碍影响。

这项研究不仅阐明了一种新型FDH的催化机制，更为生物催化领域提供了具有广泛应用潜力的分子工具。未来通过蛋白质工程优化，ChlH有望成为肽类药物修饰的通用平台技术，为创新药物研发开辟新途径。