二硫键分析新策略：自动化埃德曼降解法中双PTH-胱氨酸与PTH-半胱氨酸的合成与应用

这篇综述系统探讨了二硫键分析中双PTH-胱氨酸（diPTH-cystine）与PTH-半胱氨酸的合成及其在自动化埃德曼降解（Edman degradation, ED）中的应用。研究通过合成标准化合物，解决了传统质谱（MS/MS）和核磁共振（NMR）技术耗时且复杂的问题，提出了一种结合ED与质谱的高效工作流程，为富含半胱氨酸的肽和蛋白质结构解析提供了新思路。

　　

ABSTRACT

二硫键在肽和蛋白质中的注释过程复杂，需综合多数据集以避免结构分析中的错误分配。本研究通过重新实施埃德曼测序技术，合成了双PTH-胱氨酸和PTH-半胱氨酸作为对照，在检测到二硫键时明确其衍生物。应用该方法分析了含2-3个二硫键的肽，揭示了同一循环或分离循环中半胱氨酸的差异性连接模式，并提出了一种结合自动化埃德曼测序与质谱的联合策略，显著简化了未来富含半胱氨酸的肽和蛋白质的结构解析流程。

Graphical Abstract

研究通过合成双PTH-胱氨酸和PTH-半胱氨酸，解决了二硫键分析中的衍生物鉴定难题。开发的时间高效工作流程结合埃德曼测序与串联质谱（MS/MS），实现了复杂二硫键连接模式的全面解析。

1 Introduction

二硫键的精确分析对理解生物活性肽和蛋白质的结构与功能至关重要，但传统技术如质谱、核磁共振或X射线晶体学耗时且依赖专业人员。尽管部分还原结合埃德曼测序的方法已简化流程，但样本制备仍具挑战性。早期研究提出通过双PTH-胱氨酸形成检测二硫键，但其存在条件与产物稳定性存疑。本研究通过合成标准化合物，验证了其在现代测序系统（如Shimadzu PPSQ系列）中的适用性，并探讨了其在多重二硫键肽（如胰岛素、μ-KIIIA）分析中的潜力。

2 Materials and Methods

实验采用高效液相色谱（HPLC）纯化双PTH-胱氨酸，通过质谱（LC-ESI）和核磁共振（¹H-/¹³C-NMR）确认结构。PTH-半胱氨酸由双PTH-胱氨酸经三(2-羧乙基)膦（TCEP）还原获得。自动化埃德曼测序使用Shimadzu PPSQ-53A系统，以标准PTH-氨基酸混合物为参照，优化了二硫键检测条件。

3 Results and Discussion

3.1 Synthesis of DiPTH-Cystine

在绿色溶剂（50%甲醇/水）中合成双PTH-胱氨酸，避免了传统吡啶/水体系的毒性，产率达31%。核磁共振显示特征峰（如δ=172.59 ppm的羰基信号），证实其结构稳定性。

3.2 Incorporation in Edman Degradation

直接注入双PTH-胱氨酸（保留时间8.47分钟）与PTH-半胱氨酸（8.06分钟）至测序系统，发现后者在还原条件下（含DTT）为优势产物，且不与其它PTH-氨基酸重叠，解决了早期研究中峰归属的争议。

3.3 Application in Peptide Analysis

以胰岛素为例，C7(A)-C7(B)二硫键在同一循环中检测到PTH-半胱氨酸峰，而分离的半胱氨酸则因降解未显示信号。该结果与文献中“同循环检测效率最高”的结论一致，但超过10个循环后的可靠性仍需验证。

3.4 Workflow for Disulfide Annotation

提出分步策略：先通过埃德曼测序快速筛查同循环二硫键，再结合质谱解析复杂连接。例如，酸性蛋白酶消化可生成含相邻半胱氨酸的片段，便于ED检测。对于多重二硫键肽，需部分还原后分步分析。

4 Conclusions

双PTH-胱氨酸与PTH-半胱氨酸的合成填补了二硫键分析标准品的空白。结合埃德曼测序与质谱的联合工作流程，显著提升了结构解析效率，尤其适用于分子量≤2500 Da的肽链。未来需进一步验证其在更复杂体系（如含≥4个二硫键的蛋白质）中的适用性。

Author Contributions

D.I.与T.K.共同设计研究；Y.E.、A.T.和T.K.完成实验与数据分析；所有作者参与讨论并审阅稿件。

Conflicts of Interest

作者声明无利益冲突。