纳米尺度胶原原纤维生成探索：尖端增强拉曼成像揭示原纤维分子机制

这篇研究采用尖端增强拉曼光谱（TERS）结合原子力显微镜（AFM），首次实现了胶原原纤维（protofibrils）纳米尺度的分子振动成像。通过解析1004 cm-1苯丙氨酸呼吸模、1547 cm-1酰胺II带等特征峰的空间分布，揭示了胶原早期组装过程中分子取向与堆积密度的异质性，为细胞外基质（ECM）的力学性能形成机制提供了新见解。

　　

纳米尺度下的胶原组装密码

1 INTRODUCTION

胶原蛋白作为细胞外基质的关键结构蛋白，其独特的甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸（Gly-X-Y）重复序列形成三股螺旋结构。这种结构通过链间氢键、静电作用和疏水堆积维持稳定，在酶催化交联反应驱动下，单体原胶原分子通过横向聚集形成直径小于100 nm的原纤维中间体。这些纳米级组装体最终成熟为具有D型周期性带状结构的纤维网络，赋予组织拉伸强度和弹性。

2 EXPERIMENTAL SECTION

2.1 样品制备与形貌表征

研究采用牛跟腱I型胶原，通过pH调控的梯度稀释法在盖玻片上制备原纤维样品。原子力显微镜显示原纤维呈现管状形态，高度约30-50 nm，宽度分布均匀。为避免盐结晶干扰，样品先后用PBS和超纯水冲洗，氮气干燥后用于TERS检测。

2.2 拉曼实验系统

采用葡萄牙原型TERS系统，配置632.8 nm氦氖激光和电化学蚀刻金探针（PTTP）。在1 μm×1 μm扫描区域内获取32×32像素点阵的拉曼图谱，单个像素点积分时间5秒。通过主成分分析（PCA）降噪处理，并与共聚焦拉曼光谱（785 nm激发）结果进行对比验证。

3 RESULTS AND DISCUSSION

原子力显微镜图像清晰呈现原纤维的纳米管状结构，但未观察到成熟胶原特有的67 nm周期性条纹。TERS光谱显示出与体相拉曼显著差异的特征：酰胺I带从1660 cm^-1蓝移至1682 cm^-1，且原本在共聚焦光谱中不可见的酰胺II带（1547 cm^-1）明显增强。这种位移可能源于金探针与分子的相互作用导致的局部场效应。

空间分辨率为71.9 nm的拉曼成像图显示：苯丙氨酸呼吸模（1004 cm^-1）在原纤维表面呈锯齿状分布，暗示分子堆积密度的空间异质性；而CH₂/CH₃伸缩振动带（2850-2930 cm^-1）强度变化则可能反映激光诱导的光化学降解现象。值得注意的是，酰胺I带强度在成像过程中逐渐衰减，提示等离子体增强效应可能导致肽键断裂。

4 CONCLUSIONS

该研究成功建立了胶原原纤维的纳米级化学成像方法，揭示出早期组装过程中分子振动模式的空间分布规律。TERS与AFM联用技术为无标记研究生物大分子组装机制提供了新范式，未来可通过优化激光参数减少光损伤，进一步解析胶原纤维成熟过程中的构象转变动力学。这些发现对理解组织纤维化疾病和设计仿生材料具有重要指导意义。