靶向BcSOD1的DNA适配体：可持续农业中灰霉病防控的新策略

本文创新性地将DNA适配体（aptamer）技术应用于作物保护领域，通过SELEX技术筛选出靶向灰霉菌（Botrytis cinerea）关键毒力因子BcSOD1（铜锌超氧化物歧化酶）的高亲和力适配体SOD9.14F/SOD9.26F。研究证实该适配体可特异性抑制BcSOD1酶活性（97.5%），显著降低孢子萌发（67%）和病斑扩展（42%），并通过RNA-Seq揭示其双重作用机制：破坏真菌氧化应激（ROS）通路，同时激活番茄（Solanum lycopersicum）防御相关基因表达，为绿色农业提供新型"化学抗体"生物杀菌剂。

　　

摘要

灰霉菌（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是全球农作物主要病害，传统化学杀菌剂面临抗药性挑战。本研究首次将DNA适配体（aptamer）技术应用于作物保护，通过SELEX技术筛选出靶向灰霉菌关键毒力因子BcSOD1（铜锌超氧化物歧化酶）的适配体SOD9.14F和SOD9.26F。分子对接显示二者结合BcSOD1催化口袋，抑制酶活性达97.5%，显著降低孢子萌发（67%）和苹果/番茄病斑扩展（42%）。RNA-Seq分析揭示适配体通过干扰真菌谷胱甘肽代谢（bfu00480）和氧化还原酶活性（GO:0016616），同时激活番茄MAPK信号通路（sly04016）和植物-病原互作（sly04626）相关基因，实现"一箭双雕"的防控效果。

1 引言

灰霉菌作为全球第二大植物病原体，能侵染1000多种作物，其多药抗性菌株的涌现使新型防控策略迫在眉睫。该病原体通过超氧化物歧化酶（SODs）等抗氧化系统抵抗宿主活性氧（ROS）攻击，其中BcSOD1（Bcin03g03390）作为主要Cu/Zn-SOD，在毒力中起核心作用。适配体作为单链DNA"化学抗体"，具有高亲和力（Kd<1 nM）和稳定性，本研究首次将其应用于植物保护领域。

2 结果

2.1 BcSOD1蛋白表达与活性验证

重组表达的His标签BcSOD1（900 μg/mL）通过细胞色素c还原实验证实其超氧化物歧化活性，5 μg/mL浓度下抑制率达59%。

2.2 高亲和力适配体筛选

经9轮SELEX筛选获得SOD9.14F（Kd=1.09 nM）和SOD9.26F（Kd=0.83 nM），其三维结构预测显示可阻断BcSOD1活性位点（Confidence Score>0.8）。100 nM浓度孵育6小时即可抑制97.5%酶活性。

2.3 适配体在孢子表面的定位

荧光标记实验显示适配体特异性结合野生型灰霉菌孢子表面，而ΔBcsod1突变体信号减弱82%。分子对接表明其与BcSOD2（Bcin06g03160）仅有非功能性结合。

2.4 孢子萌发抑制

200 μM适配体使野生型孢子萌发率降低65%，但对ΔBcsod1突变体无显著影响，证实作用靶标特异性。

2.5 离体防控效果

番茄叶片实验中，200 μM SOD9.14F使病斑面积减少46%，真菌生物量（qPCR检测）下降64%；苹果果实实验显示病斑减少43%，效果接近商业杀菌剂fludioxonil。

2.6 转录组学机制

RNA-Seq揭示SOD9.26F处理导致灰霉菌1250个基因上调，涉及NADPH脱氢酶（GO:0003959）等氧化应激通路；番茄中1880个防御相关基因激活，包括水杨酸信号通路（sly00940）。有趣的是，非特异性DNA适配体Ap.AGA也能诱导部分免疫应答，提示DNA分子本身具有免疫刺激潜力。

3 讨论

本研究突破性地将适配体技术应用于植物病害防控，其双重作用机制——直接抑制病原毒力因子（BcSOD1）和激活宿主免疫（PR基因上调）——为绿色农业提供新思路。未来结合纳米载体（如PLGA）可能进一步提升胞内递送效率。与RNA干扰（SIGS）技术相比，DNA适配体具有更高稳定性，适合田间应用。

4 实验方法

关键技术包括：① 原核表达系统制备BcSOD1；② SELEX筛选结合ELONA验证；③ 激光共聚焦（CLSM）定位；④ 离体叶片/果实接种模型；⑤ Illumina NovaSeq 6000转录组测序；⑥ HDOCK分子对接分析。所有实验设3次生物学重复，数据经GraphPad Prism进行ANOVA检验（p<0.05）。