胃癌细胞外囊泡DNA全基因组甲基化图谱揭示细胞间通讯特征及其诊断价值

本研究针对胃癌早期诊断中液体活检技术的瓶颈问题，开发了Tn5辅助酶促甲基化测序结合末端加尾技术(TEMPT)，实现了亚纳克级细胞外囊泡(EV)DNA的全基因组甲基化分析。通过对58例胃癌和息肉样本的EV-DNA甲基化测序，鉴定出647个差异甲基化区域(DMRs)，构建了AUC达0.81的诊断模型，揭示了EV-DNA在细胞间通讯和免疫调控中的重要作用，为癌症早期诊断提供了新思路。

　　

在癌症诊断领域，液体活检技术因其无创性和可重复性备受关注。然而，传统循环肿瘤DNA(ctDNA)检测面临半衰期短(5-150分钟)、片段化严重等技术瓶颈。与此同时，细胞外囊泡(EV)作为细胞间通讯的重要媒介，其携带的DNA(EV-DNA)具有稳定性高、保留母细胞表观遗传特征等优势，但受限于极低含量(仅为cfDNA的1/20)和较长片段特性，全基因组甲基化分析一直难以实现。

针对这一技术难题，武汉大学团队在《Nature Communications》发表了创新性研究成果。研究人员开发了TEMPT技术，通过单适配体Tn5片段化、酶促转化未修饰胞嘧啶和末端加尾策略，成功实现了亚纳克级EV-DNA的高深度全基因组甲基化分析。研究纳入58例临床样本(44例发现队列+14例验证队列)，采用超速离心法分离血浆EV，通过透射电镜(TEM)和Western blot验证EV特性(平均粒径166.4±71.2 nm，表达CD63/TSG101/HSP70标志物)。

关键技术方法包括：1)单适配体5mC-Tn5片段化避免DNA损失；2)酶促转化(TET2/βGT/APOBEC)替代传统亚硫酸盐处理；3)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的3'端polyC加尾；4)基于随机森林算法的DMRs分析；5)非负最小二乘法(NNLS)组织来源解析。

研究结果部分：

"Whole-genome methylation profiling of extracellular vesicle DNA in gastric cancer identifies intercellular communication features"显示，TEMPT技术平均获得3.48亿读长，转化效率达99.73%。胃癌组呈现全局低甲基化趋势(晚期72.27% vs 良性74.43%，p=0.011)，647个DMRs主要富集在增强子区域。

"TEMPT robustly classifies cancer and benign cases"通过随机森林模型实现胃癌鉴别诊断(AUC=0.81)，验证队列AUC达0.8。关键DMRs邻近MK167(细胞增殖标志物)和UQCRFS1(线粒体复合体III亚基)等基因，与cfDNA甲基化谱仅有4.7%重叠，表明EV-DNA携带独特表观遗传信息。

"EV-DNA methylation profiles reveal cell migration and commu-nication signatures in cancer patients"发现DMR相关基因显著富集于细胞迁移(GO:0034329)和信号传导通路。LPAR1(促进肿瘤侵袭)和FN1(细胞连接组装)等基因的甲基化改变，揭示了EV参与肿瘤微环境重塑的分子机制。

"TEMPT identifies immune cells as a major EV origin in gastric cancer samples"通过甲基化特征溯源发现，巨噬细胞(2.3倍)和浆细胞(2.8倍)在胃癌EV-DNA中贡献增加，FYN(调控T细胞活化)等基因的甲基化改变提示免疫细胞是EV-DNA的重要来源。

该研究创新性地建立了低输入EV-DNA甲基化分析技术体系，不仅为胃癌早期诊断提供了新型生物标志物，更揭示了EV介导的细胞间通讯在肿瘤进展中的调控机制。特别值得注意的是，EV-DNA甲基化特征能反映免疫微环境变化，这为理解肿瘤免疫逃逸提供了新视角。技术层面，TEMPT克服了传统亚硫酸盐处理的DNA降解问题，将所需样本量降低至亚纳克级，为液体活检技术发展开辟了新方向。未来扩大临床队列和探索EV异质性将进一步提升该技术的转化应用价值。