基于RNP递送的融合DNA结合域胞嘧啶碱基编辑器实现编辑窗口精准调控

本研究针对胞嘧啶碱基编辑器(CBE)存在的编辑窗口过宽、脱靶效应等问题，开发了两种新型重组蛋白格式编辑器"Flexible"和"Precision"。通过融合噬菌体单链DNA结合蛋白(SSB)实现编辑窗口精准调控，结合尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)共递送策略，显著提高C-to-T编辑纯度至96%，同时降低indel形成率。该研究为临床级基因治疗提供了高特异性RNP递送方案，相关成果发表于《BMC Biotechnology》。

　　

基因编辑技术正在重塑生命医学研究格局，其中CRISPR-Cas9系统通过引导RNA(gRNA)靶向切割DNA的特性，已成为基因组工程的革命性工具。然而传统方法依赖双链断裂(DSB)和同源定向修复(HDR)，存在效率低、随机插入缺失(indel)风险高、供体DNA毒性等问题。2016年，Liu实验室开发的碱基编辑技术绕过DSB直接实现单碱基转换，其中胞嘧啶碱基编辑器(CBE)通过融合胞嘧啶脱氨酶与Cas9n切口酶，将C•G碱基对转化为T•A。尽管该技术已成功应用于临床治疗遗传病案例，但仍面临编辑窗口过宽导致的"旁观者编辑"、碱基切除修复(BER)导致的编辑逆转等挑战。

为突破这些限制，Erin Brettmann团队在《BMC Biotechnology》发表研究，开发了两种创新性CBE蛋白。研究人员采用大肠杆菌表达系统，通过FPLC纯化获得高纯度蛋白，结合体外编辑实验、深度测序分析和细胞模型验证，系统评估了编辑特性。关键技术包括：噬菌体SSB结构域融合工程、UGI共递送优化、PEXBUFF转染增强剂应用，以及基于MiSeq平台的NGS分析。

编辑窗口调控的CBE变体设计

研究团队首先构建了基于人APOBEC3B(A3B)脱氨酶域的CBE基础架构，通过引入T4/T7噬菌体单链DNA结合蛋白(SSB)，发现N端融合SSB的变体保持编辑活性，而脱氨酶-nCas9间插入SSB则导致活性丧失。其中T4 SSB变体编辑效率显著高于T7，最终开发的"Precision"编辑器将编辑窗口从13nt(Flexible)缩窄至7nt，实现靶标胞嘧啶的精准区分。

UGI递送策略优化

与传统认知不同，研究发现融合UGI结构域在RNP格式中反而降低编辑效率。通过共递送独立UGI蛋白，C-to-T编辑比例从74%(Flexible)和82%(Precision)提升至95%以上，同时将indel率降低2-4倍。值得注意的是，甲基化胞嘧啶编辑后生成胸腺嘧啶而非尿嘧啶，因此不受BER影响，这为靶向甲基化区域编辑提供了独特优势。

递送系统特异性验证

RNP格式相比质粒递送展现出显著优势：在EMX1-11错配靶点，质粒组产生8.7%脱靶编辑，而RNP组仅0.3%；正交R-loop实验证实RNP可完全避免向导非依赖的全基因组脱靶编辑。转染增强剂PEXBUFF使编辑效率提升3倍，且与UGI具有协同效应。

分子机制解析

通过设计包含TC/CC/AC/GC二核苷酸的体外编辑系统，证实编辑器对TC序列偏好性最强，CC次之。甲基化敏感性实验显示，非靶链甲基化使编辑效率降低50-75%，而靶链甲基化无影响。这种特性提示临床应用中需考虑靶点甲基化状态进行gRNA设计。

多细胞类型适用性

在K562悬浮细胞中，Precision编辑器实现57.3%编辑效率；原代T细胞中虽效率降低但保持高特异性，且细胞活力未受影响。该特性解决了质粒递送对A549等细胞的毒性问题，为难转染细胞提供了可行方案。

这项研究通过蛋白质工程创新，实现了CBE编辑窗口的可控调节，建立了高特异性RNP递送体系。其核心价值在于：商业级蛋白生产方案使更多实验室可获取高质量CBE；SSB融合策略为需要精准单碱基编辑的临床场景提供解决方案；UGI共递送概念革新了碱基编辑的修复调控方式。这些突破不仅推动基础研究工具发展，更为遗传病治疗、CAR-T细胞改造等临床应用奠定了技术基础。