CLE19通过BSL-BIN2模块抑制油菜素内酯信号输出以维持BES1活性和花粉外壁模式形成

这篇研究揭示了拟南芥中CLE19肽通过PXL1受体激活BSL-BIN2-BES1级联通路，特异性磷酸化转录因子BES1的S219/S223位点，从而拮抗油菜素内酯（BR）信号、调控绒毡层功能与花粉外壁发育稳态的分子机制。

　　

摘要

花粉外壁作为开花植物雄性育性的保护屏障和信号界面，其精确模式化依赖于小孢子与绒毡层细胞的协同互作。CLAVATA3/胚胎周围区域相关肽CLE19被鉴定为小孢子衍生的"刹车"信号，但其与激素通路的整合机制尚不明确。本研究通过定量磷酸化蛋白质组学发现，CLE19通过激活BSL-BIN2-BES1级联通路拮抗油菜素内酯（BR）信号输出。

CLE19调控的磷酸化蛋白质组揭示BR信号组分富集

通过比较拟南芥野生型、CLE19过表达（CLE19-OX）和显性负性（DN-CLE19）株系花蕾的磷酸化谱，鉴定到782-1,271个差异磷酸化肽段。GO分析显示BR信号组分显著富集，包括BSL1/2/3磷酸酶、GSK3样激酶BIN2和转录因子BES1等13个关键调控因子。其中BSL1、BIN2和BES1在CLE19-OX中呈现磷酸化增强，暗示CLE19可能通过翻译后修饰调控BR通路。

CLE19与BR信号拮抗调控花粉外壁形成

表型分析显示，BR受体突变体bri1-301和CLE19-OX均产生外壁结构破碎的花粉，而DN-CLE19则出现外壁过度增厚。qRT-PCR证实MYB35、AMS等外壁标记基因在两者间呈现相反表达模式。转录组交叉分析发现428个核心基因受CLE19与BR信号反向调控，其中86.7%涉及孢粉素合成和花粉形态建成相关通路。

CLE19不干扰BR生物合成或受体复合体

实验排除了CLE19通过影响BR生物合成基因（DWF4、CPD等）或破坏BRI1-BL-SERK1受体复合体形成的可能性。凝胶过滤实验表明，CLE19及其同源肽均不能干扰BRI1^LRR-SERK1^LRR复合体的组装，暗示其作用位点位于BR受体下游。

CLE19受体PXL1与BSL1/2/3互作

Co-IP/MS筛选发现CLE19受体PXL1直接结合BSL型磷酸酶。荧光互补（LCI）和共免疫沉淀证实PXL1特异性互作BSL1/2/3而非BSU1。在烟草体系中，CLE19处理可增强PXL1-BSL1互作并促进BSL1磷酸化，建立了肽信号与BR调控因子的直接分子链接。

BSLs-BIN2-BES1模块在绒毡层的功能表征

原位杂交显示BSL1/2/3、BIN2和BES1在花药第6-8期绒毡层高表达。遗传分析发现bsl1 bsl2 bsl3三突和BIN2功能获得突变体bin2-1均呈现外壁缺陷，表型模拟CLE19-OX；而BSL1过表达株和bin2-3 bil1 bil2三突则表现外壁过度沉积，与DN-CLE19类似。这些证据支持该级联通路在空间和时间上具备调控花粉发育的分子基础。

CLE19通过BSL-BIN2促进BES1磷酸化

蛋白质印迹显示，CLE19处理使BES1磷酸化形式（pBES1）比例从0.20升至0.60，且蛋白酶体抑制剂MG132可协同增强该效应。在bri1-301中CLE19仍能诱导BES1磷酸化，但在bsl1 bsl2 bsl3和bin2-3 bil1 bil2突变体中失效，证明该过程独立于BRI1但依赖完整BSL-BIN2模块。

S219/S223位点决定BES1核质穿梭

磷酸化质谱鉴定到BES1 C端BIN2作用域内S219/S223为CLE19响应位点。构建的磷酸化缺陷型BES1^S2A-EYFP在绒毡层核内持续累积，而磷酸模拟型BES1^S2D-EYFP则主要滞留胞质。共聚焦显微镜观察发现，CLE19处理使野生型BES1-YFP核信号降低42%，但对BES1^S2A无影响，证实这两个丝氨酸残基是CLE19诱导核输出的分子开关。

BES1磷酸化状态决定花粉外壁模式

转基因分析显示，BES1^S2A-EYFP株系产生外壁过度沉积的花粉，模拟DN-CLE19表型；BES1^S2D-EYFP则出现外壁结构缺陷，类似CLE19-OX。将BES1^S2A导入CLE19-OX背景可部分回救花粉表型和AMS等靶基因表达，证明S219/S223磷酸化是CLE19-BR信号交叉对话的核心节点。

讨论与展望

该研究首次阐明小孢子源性肽信号通过"PXL1-BSLs-BIN2-BES1"级联精确调控绒毡层BR响应的分子框架。不同于传统激素信号，CLE19通过特定位点磷酸化控制BES1的核质穿梭和蛋白稳定性，为理解植物肽-激素协同调控发育可塑性提供了新范式。未来研究可探索其他CLE成员是否共享类似机制，以及该通路在作物雄性不育调控中的应用潜力。