克服关键酶瓶颈：系统代谢工程提升枯草芽孢杆菌番茄红素产量

这篇研究通过系统代谢工程改造枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），解决了C40类胡萝卜素番茄红素（lycopene）生物合成的关键酶瓶颈问题。研究团队筛选出高效多功能香叶基香叶基焦磷酸合成酶（GGPPS），并优化甲基赤藓糖醇磷酸（MEP）途径限速酶Dxs的表达，使番茄红素产量提升至55 mg/L（较前提高10倍），为GRAS（公认安全）微生物合成高价值化合物提供了新策略。

　　

1 引言

作为GRAS（Generally Recognized As Safe）微生物的枯草芽孢杆菌，因其安全性和工业发酵优势成为高价值化合物的理想合成底盘。然而，其C₄₀类胡萝卜素（如番茄红素）产量长期受限于前体供应不足和酶功能不兼容。番茄红素作为强效抗氧化剂，在食品和医药领域需求旺盛，但现有生产主要依赖非GRAS宿主（如大肠杆菌）。本研究旨在通过靶向改造MEP途径和筛选高效GGPPS酶，突破枯草芽孢杆菌合成番茄红素的关键瓶颈。

2 材料与方法

研究以枯草芽孢杆菌168为宿主，构建含crtE/crtB/crtI基因的异源表达载体。通过替换不同来源的GGPPS酶（如Archaeoglobus fulgidus的gps和Corynebacterium glutamicum的idsA），评估其对番茄红素合成的影响。采用葡萄糖-甘油混合碳源优化发酵条件，并过表达MEP途径限速酶基因dxs和dxr。产物通过HPLC定量，细胞生长通过OD₆₀₀监测。

3 结果

3.1 功能性番茄红素途径的构建

初始使用Pantoea agglomerans的crtE基因未能检测到番茄红素，而替换为A. fulgidus的多功能GGPPS（gps）后成功实现合成，证实CrtE酶在枯草芽孢杆菌中存在宿主特异性失活。

3.2 碳源优化

5%葡萄糖+5%甘油混合碳源使细胞密度和番茄红素产量均显著高于单一碳源（10%葡萄糖或甘油），表明甘油通过DHAP（二羟丙酮磷酸）更高效进入MEP途径。

3.3 限速酶工程

过表达dxs使番茄红素产量提升5倍（72小时达20 mg/L），而过表达dxr反而降低产量30%，证实Dxs是MEP途径的主要限速节点。

3.4 GGPPS酶筛选

C. glutamicum的idsA表现最优，产量达40 mg/L（较gps提高1.9倍），而番茄来源的SlG1完全无效，凸显原核酶在细菌宿主中的兼容性优势。

3.5 发酵延长实验

延长培养至144小时，最终产量达55 mg/L，但碳源未耗尽提示后期可能受NADPH供应或营养限制。

4 讨论

研究揭示了枯草芽孢杆菌合成番茄红素的两大核心瓶颈：FPP（法尼基焦磷酸）节点的代谢竞争和MEP途径前体不足。通过选择绕过FPP的多功能GGPPS（如idsA）和靶向dxs过表达，成功规避宿主固有代谢通路的干扰。值得注意的是，葡萄糖-甘油的时序利用策略有效分离生长与生产阶段，而dxr的负面效应警示代谢工程需避免过度扰动天然通路平衡。

5 结论

本研究通过酶适配性和前体供应双轨优化，将枯草芽孢杆菌番茄红素产量提升至55 mg/L，为GRAS微生物生产高价值萜类化合物提供了可推广的工程范式。未来需进一步优化辅因子供应和发酵工艺，以推动其工业化应用。