多倍体进化研究新突破：天然多倍体植物Tragopogon mirus中同源基因特异性编辑系统的开发

这篇研究开创性地在天然多倍体植物Tragopogon mirus（4x）中建立了同源基因特异性CRISPR/Cas9编辑平台，以MYB10和DFR基因为例实现了靶向同源基因（homeolog）的精准敲除（编辑效率达35.7%-45.5%），且未检测到脱靶事件。该工作为解析多倍化（WGD）后基因剂量变化对表型的影响提供了关键技术手段，填补了非模式多倍体植物功能研究的空白，对理解植物多倍体基因组进化规律和作物改良具有双重意义。

　　

1 引言

多倍化（Whole-genome duplication, WGD）是植物进化的重要驱动力，现存35%的维管植物通过多倍化形成。异源多倍体（allopolyploid）中同源基因（homeolog）会经历不同命运：部分基因保留为重复拷贝（如编码蛋白复合体亚基或转录因子的基因），部分则恢复为单拷贝。然而，基因剂量变化的表型效应机制尚不明确，主要受限于缺乏多倍体同源基因特异性编辑工具。

北美婆罗门参属（Tragopogon）是研究多倍体即时效应的天然模型，其异源四倍体T. mirus（4x）由T. dubius和T. porrifolius（2x）杂交形成。前期研究已在该物种建立CRISPR/Cas9系统，但同源基因特异性编辑仍属空白。

2 材料与方法

研究选用参与花青素合成通路的MYB10（R2R3型转录因子）和DFR（二氢黄酮醇4-还原酶）基因为靶标。通过基因组比对发现：

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  MYB10的靶位点存在1个SNP差异（T. dubius为A，T. porrifolius为G）

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  DFR的两个靶位点分别存在5个SNP和1个PAM序列差异

设计特异性sgRNA后，通过农杆菌介导转化T. mirus叶片外植体，经组织培养获得转基因植株。

3 结果

3.1 同源基因特异性编辑

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  MYB10实验中，35.7%转基因植株在T. porrifolius同源基因出现单等位基因编辑（-12nt缺失或+1nt插入）

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  DFR实验中，45.5%植株靶向编辑T. porrifolius拷贝，其中9.1%实现双等位基因编辑（-3nt缺失）

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  所有实验均未检测到T. dubius同源基因的脱靶编辑

3.2 编辑效率优化

相比单sgRNA（MYB10），双sgRNA（DFR）策略将编辑效率提升10%。靶位点选择策略包括：

1）利用PAM序列存在/缺失差异（如DFR exon3靶点）

2）在seed序列（PAM上游10nt）设计SNP差异（如MYB10靶点）

4 讨论

该研究首次在非模式多倍体实现同源基因特异性编辑，但T₀代双等位突变率较低（<10%）。未来可通过以下策略优化：

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  增加sgRNA数量（如3-4个）

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  联合CRISPR/Cas9与Cas12a系统（识别TTTN PAM）

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  利用T₁代获得双等位突变体

该技术为解析多倍体基因组进化关键问题奠定基础：

1）不同亲本同源基因丢失对蛋白互作网络的影响

2）单拷贝基因保留的选择压力机制

3）亚基因组优势（subgenomic dominance）的形成原因

研究团队特别指出，MYB10和DFR突变体的系统表型分析将是下一步重点，这些数据有望揭示花青素通路中同源基因的功能分化规律。