基于CRISPR/Cas12a理性设计的全位点单核苷酸多态性精准检测新策略

本研究通过理性设计激活链（ssAS13+3-X），创新性优化crRNA互补区长度和3′端随机延伸序列架构，显著提升CRISPR/Cas12a系统对任意位置单核苷酸多态性（SNP）的区分能力。该技术利用"RESET效应"实现无需预扩增的0.1%低频突变检测，为分子诊断（POCT）、病原监测和精准医疗提供了高特异性、一体化的解决方案。

　　

亮点

我们开发的ssAS13+3-X激活链通过结构优化，使CRISPR/Cas12a系统具备全序列覆盖的单核苷酸分辨率，突破传统技术对突变位置的限制。这种"设计即检测"的策略为临床样本中的稀有突变筛查提供了革命性工具。

材料与试剂

实验采用HPLC纯化的寡核苷酸（表S1-13）和Lba Cas12a（cpf1）蛋白，反应体系包含New England Biolabs提供的2.1×缓冲液（500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl₂, pH 7.9）。所有RNA寡核苷酸由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。

激活链工程实现SNP鉴别

基因突变是细胞癌变的关键调控因素。本研究通过系统改造激活链的crRNA结合域（13nt核心区+3nt延伸）和3′端柔性尾（X），使Cas12a能敏锐识别靶序列任意位点的错配，包括传统方法难以检测的近末端突变。

结论

该技术将RESET效应（随机延伸增强反式切割活性）与精密设计的激活链相结合，不仅深化了对CRISPR/Cas12a调控机制的理解，更建立了适用于复杂临床场景的通用检测平台。其单链结构的长度耐受性为多样化基因组分析开辟了新途径。

作者贡献声明

李庆楠：论文撰写/实验设计/数据可视化；黄浩然/李若妍：数据可视化；侯晓云/杨淇帆：方法开发；姜鸿鑫/蔡启良：实验执行；孔德明：课题指导。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本研究结果的财务或个人关系。

致谢

感谢国家自然科学基金（22474063）和天津市自然科学基金重点项目（24JCZDJC00290）的资助。