基于RPA-PfAgo技术的肉类物种快速鉴定系统开发与验证：解决食品欺诈与监管难题的创新方法

为解决肉类掺假和食品标签欺诈问题，研究人员开发了一种结合重组酶聚合酶扩增(RPA)和激烈火球菌Argonaute蛋白(PfAgo)的新型检测系统。该研究通过系统优化关键参数，实现了鸭肉、鸡肉、牛肉、猪肉和羊肉的快速（30分钟）、高灵敏度（最低检测限100-103拷贝/μL）和特异性鉴别，为食品供应链透明化提供了现场检测解决方案。

　　

肉类掺假和食品标签欺诈是全球食品安全的重大挑战。2013年欧洲马肉丑闻事件后，欧盟强制要求成员国对肉制品进行DNA检测。传统检测方法如PCR、ELISA和光谱分析虽各具优势，但普遍存在设备依赖性强、操作复杂或成本高等局限，难以满足现场快速检测需求。尤其对于清真食品认证和过敏原规避等场景，准确鉴别肉类物种具有重要公共卫生和商业意义。

为突破技术瓶颈，来自韩山师范学院的Yaqun Liu、Yuzhong Zheng团队在《Applied Food Research》发表研究，创新性地将重组酶聚合酶扩增(RPA)技术与激烈火球菌Argonaute(PfAgo)蛋白结合。研究人员从5种常见肉类线粒体基因组中筛选特异性序列，设计多组RPA引物和引导DNA(gDNA)，通过系统优化MgAc浓度(2.0-3.0 μL)、反应温度(35-45°C)和时间(15-30分钟)等参数，建立了一套完整的检测体系。实验采用商业肉制品和人工掺假样本进行验证，并与传统PCR方法对比。

研究结果显示：在"RPA-PfAgo检测平台设计策略"部分，通过平衡gDNA长度（16 nt）与PfAgo蛋白切割特性，解决了短gDNA结合不稳定与长gDNA空间位阻的矛盾。"RPA引物和gDNA筛选"环节证实，F1R1-F1R3（鸭）、F3R1-F3R3（鸡）等引物组合能产生单一清晰条带，gDNA41（鸭）和gDNA45（鸡）等显示出最佳切割效率。"RPA参数系统优化"表明不同肉类需要差异化条件，如鸭肉需2.3 μL MgAc和37°C，而羊肉需45°C反应25分钟。

在"RPA-PfAgo平台多参数优化"中发现，鸭肉需要20 μM探针浓度（其他肉类10 μM），暗示其基因组结构特殊性。评估显示该系统重复性优异（变异系数<10%），对商业样品检测准确率与PCR一致，且能识别1:1掺假样本。灵敏度测试中，鸡肉检测限达1×10⁰拷贝/μL，显著优于传统RPA方法。

讨论部分指出，该技术相比RPA-CRISPR/Cas12a具有更小分子量（无需RNA介导）和无PAM序列限制的优势。虽然目前存在步骤分离可能引起气溶胶污染的问题，但未来开发一体化反应体系可进一步简化流程。研究扩展了PfAgo在食品安全领域的应用，为市场监管提供了便携式解决方案，特别适用于缺乏专业实验室的边远地区。该技术还可延伸至鱼类、乳制品等其他动物源性食品检测，具有广阔的商业化前景。