基于RPA-CRISPR/Cas12a技术的布鲁氏菌快速灵敏检测方法开发

本研究创新性地将重组酶聚合酶扩增(RPA)与CRISPR/Cas12a系统结合，开发出具有荧光(FL)和侧向层析试纸条(LFS)双读数的布鲁氏菌检测方法。该技术灵敏度达1拷贝/μL（较qPCR提升10倍），特异性100%，临床验证与血清学结果完全一致，为资源有限地区提供了快速、精准的现场诊断方案。

　　

ABSTRACT

布鲁氏菌病作为重要的人畜共患病，其快速准确诊断对疾病防控至关重要。研究团队开发的新型检测方法将重组酶聚合酶扩增(RPA)与CRISPR/Cas12a系统整合，通过荧光(FL)和侧向层析试纸条(LFS)实现双通道检测。RPA-CRISPR/Cas12a-FL法的检测限达1拷贝/μL，灵敏度较定量PCR(qPCR)提高10倍；而RPA-CRISPR/Cas12a-LFS法则达到10拷贝/μL，与巢式PCR相当。特异性测试显示该方法仅对布鲁氏菌产生强信号，与其他细菌无交叉反应。24例确诊患者和6例健康对照的临床验证显示，检测结果与血清学完全一致，凸显其临床应用价值。

IMPORTANCE

该研究突破传统诊断技术局限，首次将RPA与CRISPR/Cas12a系统整合应用于布鲁氏菌检测。创新的单管反应体系可在1小时内完成检测，兼具实验室精准性和现场适用性，为高发地区的疾病监测提供了革命性工具。

INTRODUCTION

布鲁氏菌病由革兰阴性兼性胞内菌布鲁氏菌属引起，其中羊种布鲁氏菌(B. melitensis)致病性最强。传统培养法需耗时数周，血清学检测存在窗口期和交叉反应，而PCR技术受限于设备要求。RPA技术可在37-42°C恒温条件下20分钟内完成核酸扩增，但存在非特异性扩增风险。CRISPR/Cas12a系统通过TTTV原间隔相邻基序(PAM)识别靶标后激活非特异性切割活性，二者结合可显著提升检测性能。

RESULTS

检测体系的建立与优化

以omp31基因为靶标，通过crRNA筛选确定crRNA1为最优向导RNA（荧光强度提升3.8倍），RPA引物筛选显示F3R3组合扩增效率最高。棋盘法优化确定Cas12a蛋白和crRNA最佳工作浓度分别为1 μM和0.8 μM，探针浓度优化为10 μM。创新的单管反应设计将RPA扩增（15分钟）与CRISPR检测（45分钟）无缝衔接。

灵敏度与特异性验证

梯度稀释实验显示，FL法可稳定检测1拷贝/μL的质粒模板（P<0.0001），较qPCR的10拷贝/μL提升一个数量级；LFS法则与巢式PCR相当（10拷贝/μL）。特异性测试中，6种非目标菌（包括霍乱弧菌、肺炎克雷伯菌等）均未产生假阳性信号，仅布鲁氏菌样本出现显著荧光增强或试纸条显色带。

临床样本验证

30例临床血清检测显示，24例血清学阳性样本全部检出，6例阴性对照均无信号，与qPCR结果完全一致。值得注意的是，该方法在慢性感染样本中仍保持高检出率，克服了血培养灵敏度随病程下降的缺陷。

DISCUSSION

相较于传统方法，该技术具有三大优势：1) 检测时间从数天缩短至1小时；2) 设备需求从PCR仪简化为恒温装置；3) 通过crRNA设计确保单碱基分辨力。局限性在于尚未验证对其他布鲁氏菌种（如牛种、猪种）的检测效能，且LFS灵敏度略低于FL法。未来可通过延长反应时间或结合数字读片设备进一步优化。

MATERIALS AND METHODS

研究使用DNeasy试剂盒提取细菌及血清基因组DNA，通过TA克隆构建pMD-19T-omp31质粒标准品。crRNA和RPA引物通过Primer Premier 6软件设计，采用TwistAmp Basic试剂盒进行RPA扩增。LFS检测采用生物素标记探针，反应25分钟后用PBS缓冲液稀释上样，5-10分钟肉眼判读结果。所有实验均设三次技术重复。

创新价值展望

这项研究不仅为布鲁氏菌病诊断提供了新一代分子工具，其模块化设计更为其他病原体检测提供了技术范式。特别是双读数系统的设计，既满足实验室精准定量需求，又适应偏远地区的现场筛查，在公共卫生应急和动物疫病防控领域具有广阔应用前景。