正交CRISPR系统实现非病毒工程化异体CAR-T细胞的多重基因编辑与靶向整合

【编辑推荐】为开发更安全高效的异体CAR-T疗法，研究人员结合S. aureus Cas9 (SaCas9)碱基编辑器和S. pyogenes Cas9 (SpCas9)核酸酶，建立正交CRISPR系统，实现B2M/REGNASE-1基因DSB-free敲除（编辑效率达66%-84%）与TRAC位点抗CD19 CAR靶向整合（效率达36%-71%），显著降低染色体易位风险210倍，为临床级CAR-T制备提供新策略。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，异体嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法面临多重挑战：既要避免移植物抗宿主病（GVHD），又需克服宿主免疫排斥，同时需增强细胞持久性。传统CRISPR/Cas9系统通过双链断裂（DSB）实现基因编辑，但易导致染色体易位等基因组毒性。而碱基编辑器（Base Editor）虽能实现无DSB编辑，却难以同时完成多基因敲除和大片段转基因整合。

来自丹麦奥胡斯大学（Aarhus University）的Nanna S. Mikkelsen团队在《Molecular Therapy》发表研究，创新性地将两种CRISPR系统正交组合：采用金黄色葡萄球菌Cas9（SaCas9）碱基编辑器敲除人类白细胞抗原B2M（避免异体排斥）和调控因子REGNASE-1（增强细胞持久性），同时用化脓链球菌Cas9（SpCas9）在T细胞受体α恒定区（TRAC）位点精准整合抗CD19 CAR基因。这种"双管齐下"策略既规避了DSB风险，又实现了多重基因组改造。

关键技术包括：1）使用原代人类T细胞进行非病毒转染；2）设计SaCas9-腺苷脱氨酶融合蛋白实现B2M/REGNASE-1位点的C>T碱基转换；3）通过单链DNA（ssDNA）或腺相关病毒AAV6模板介导CAR在TRAC位点的靶向整合；4）全基因组测序评估染色体异常。

【多重编辑效率突破】

实验数据显示，B2M和REGNASE-1的碱基编辑效率分别达到66%和84%，而CAR在TRAC位点的整合效率因模板不同呈现差异：非病毒ssDNA模板为36%，AAV6病毒模板高达71%。这种效率组合远超同类研究。

【安全性显著提升】

全基因组分析揭示，碱基编辑组染色体平衡易位发生率比传统CRISPR组降低210倍。体外细胞毒性实验证实，编辑后的CAR-T细胞对CD19⁺肿瘤细胞的杀伤活性未受影响。

【体内外功能验证】

小鼠模型显示，经过三重编辑的CAR-T细胞不仅有效清除肿瘤，且存活时间延长。流式细胞术检测发现REGNASE-1敲除显著提升了记忆T细胞比例，这可能是持久性增强的关键机制。

该研究开创性地将正交CRISPR系统应用于临床级CAR-T制备：SaCas9碱基编辑器负责"减法编辑"（基因敲除），SpCas9核酸酶专注"加法工程"（CAR整合），二者协同实现1+1>2的效果。尤为重要的是，非病毒载体策略大幅降低了生产成本和监管风险，为异体CAR-T的工业化生产铺平道路。研究建立的"模块化编辑工具箱"可灵活适配不同靶点，为下一代通用型细胞疗法开发提供了范式转移。