脂滴选择性荧光探针：实时成像与极性感知在代谢性疾病研究中的应用

本文推荐一种新型脂滴（LDs）靶向荧光探针，其基于分子内电荷转移（ICT）机制，具备优异的选择性、生物相容性与极性响应能力，可实时监测活细胞中LDs动态变化及早期肝脂肪变性（hepatic steatosis），为代谢性疾病研究提供关键工具。

　　

引言

脂滴（Lipid Droplets, LDs）是起源于内质网的动态细胞器，由中性脂质核心和磷脂单层膜及其相关蛋白构成。它们远非被动的脂肪储存结构，而是通过与其他细胞器（如线粒体和溶酶体）相互作用，主动参与脂质代谢、能量稳态和细胞应激反应的调控。LDs数量、大小或极性的改变与多种代谢性疾病密切相关，包括脂肪肝、肥胖、糖尿病和动脉粥样硬化等。药物性肝损伤也常与脂质代谢紊乱相关，突显了监测LDs行为及氧化应激标志物的重要性。

与传统技术（如肝活检和血清分析）相比，荧光显微成像具有高分辨率、低损伤的优势，因此开发高特异性、高亮度、良好生物相容性且能识别脂质微环境变化的LDs探针，对于理解脂质相关病理过程及改善诊疗策略具有重要意义。

材料与方法

仪器与试剂

核磁共振氢谱（¹H NMR）和碳谱（¹³C NMR）使用Bruker 300 MHz谱仪测定，以氘代氯仿为溶剂，四甲基硅烷（TMS）为内标。质谱（MS）采用电喷雾电离（ESI）模式或MALDI-TOF质谱仪测定。柱层析使用硅胶60（0.063–0.200 mm）。紫外-可见吸收光谱使用Thermo Scientific Evolution 201 spectrophotometer记录，荧光光谱使用Scinco FS-2荧光光谱仪记录。

探针1的合成

将4-(二苯氨基)苯甲醛（2）和苯并噻唑-2-乙腈（3）溶于无水乙醇，加入一滴哌啶作催化剂，回流过夜。反应混合物冷却后减压过滤，固体用乙醇洗涤，得到化合物1，产率59.2%。其结构经¹H NMR、¹³C NMR和高分辨质谱（HRMS）确认。

理论计算

所有密度泛函理论（DFT）和含时密度泛函理论（TDDFT）计算均使用Gaussian 16软件完成，采用CAM-B3LYP/TZVP理论水平进行几何优化，并通过频率计算确认无虚频。使用Grimme’s D3校正进行色散修正，采用SMD模型纳入溶剂化效应（水、THF、甲苯）。电子-空穴分析使用Multiwfn 3.8进行。偶极矩和溶剂化能量基于优化结构在CAM-B3LYP-D3/ma-def2TZVP水平计算。

光谱分析

将化合物1的DMSO储备液（1 mM）稀释至不同溶剂（水、DMSO、甲醇、乙腈、乙醇、THF、DMF、甲苯）中，终浓度为10 μM，测定其紫外-可见吸收和荧光发射光谱。

活性氧检测

使用DCFH-DA作为总活性氧（ROS）指示剂，DHE作为超氧阴离子（O₂^?）指示剂，ABDA作为单线态氧指示剂。将含有检测探针和化合物1（10 μM）的PBS溶液置于比色皿中，用白光LED（50 mW/cm2）照射，每次30秒，总时长120秒，每次照射后立即测量荧光。仅含指示剂的溶液作为对照。

细胞培养与毒性测试

HeLa细胞使用含10%胎牛血清和青霉素/链霉素的MEM培养基，在37°C、5% CO₂条件下培养。细胞毒性通过MTT法评估：细胞与不同浓度化合物1（0–50 μM）共孵育24小时后，加入MTT溶液继续培养4小时，随后加入DMSO溶解甲臜晶体，测定吸光度。

共定位成像

HeLa细胞接种于35 mm玻璃底培养皿，密度为3×10⁵ cells/dish。部分细胞用200 μM油酸（Oleic Acid, OA）预处理不同时间（3 h或12 h）以诱导LDs形成。细胞与化合物1（10 μM）孵育30分钟，BODIPY 493/503孵育15分钟，PBS洗涤后使用Olympus Fluoview 1200共聚焦显微镜成像。使用Pearson相关系数定量共定位程度。

结果与讨论

合成与光谱特性

化合物1通过Knoevenagel缩合反应合成，产率中等。其结构已在此前的研究中被报道为具有扭曲分子内电荷转移（TICT）和聚集诱导发光（AIE）特性的D-π-A结构分子之一。

在不同溶剂中，化合物1的吸收光谱均在485 nm附近出现宽谱带，表明其基态电子结构受溶剂极性扰动较小。相反，其发射光谱表现出明显的溶剂依赖性：在高极性溶剂（如水、DMSO）中，发射峰位于>600 nm；而在低极性溶剂（如甲苯）中，发射峰蓝移至550–600 nm。特别是在乙醇中，荧光强度相对较高。这种发射行为符合分子内电荷转移（ICT）机制的特征：在极性环境中，ICT激发态更稳定，导致发射红移；而在非极性环境中，ICT态稳定化作用减弱，HOMO-LUMO能隙增大，发射能量增高，从而出现蓝移。这些光物理特性表明化合物1对环境极性高度敏感，具备作为脂质微环境极性探针的潜力。

理论计算分析

为深入探究其光物理行为，研究人员进行了DFT和TDDFT计算。将分子划分为给体、连接单元和受体三部分。优化后的基态（S₀）和第一激发态（S₁）结构显示，S₀态分子呈略微扭曲构象（D2二面角约38°），而S₁态则变得更加平面（D2角降至2°）。电子-空穴分析清晰表明，在所有测试溶剂（水、THF、甲苯）中，S₁态均表现出显著的ICT特征，约有0.29个电子从给体部分转移至受体部分。

分子轨道分析表明，在所有情况下，S₀ → S₁的激发主要对应于HOMO→LUMO的跃迁（贡献度73%–76%）。随着溶剂极性降低，HOMO和LUMO的能级均发生变化，且HOMO-LUMO能隙逐渐增大，这直接解释了发射光谱蓝移的原因。

根据Lippert-Mataga方程，斯托克斯位移（Δν）与激发态和基态偶极矩之差（Δμ）的平方以及溶剂极性参数（Δf）成正比。计算得到的偶极矩数据显示，在所有溶剂中，S₁态的偶极矩均显著大于S₀态。水的Δμ变化远大于甲苯，且其Δf值（0.3200）也显著高于甲苯（0.0633），因此在水中的斯托克斯位移最大，而在甲苯中最小的实验现象得到了合理解释。

此外，溶剂化能的计算表明，所有溶剂对S₁态的稳定化作用（溶剂化能）均大于S₀态，从而缩小了S₁与S₀态之间的能隙。水的溶剂化能差（ΔE_S1/S0 = 48.9 kcal/mol）是甲苯（22.7 kcal/mol）的两倍以上，这意味着水对能隙的缩小作用更强，从另一个角度解释了极性溶剂中发射红移而非极性溶剂中蓝移的原因。

细胞毒性评估

MTT实验结果表明，HeLa细胞与浓度高达30 μM的化合物1共孵育24小时后，细胞存活率仍保持在90%以上，表明该探针具有极低的细胞毒性和优异的生物相容性，适用于活细胞成像研究。

荧光细胞成像与共定位

共聚焦显微镜成像显示，化合物1（红色荧光）与商品化LDs染料BODIPY 493/503（绿色荧光）在HeLa细胞中具有高度共定位。在未处理（正常）细胞中，共定位Pearson系数为0.901，证实了化合物1对LDs的特异性靶向能力。

用油酸（OA）预处理细胞以诱导LDs形成后，随着处理时间延长（3 h和12 h），细胞内LDs的数量和尺寸显著增加。化合物1的荧光信号与BODIPY信号的共定位程度进一步提高，Pearson系数分别达到0.950（3 h）和0.963（12 h）。这些结果强有力地证明了化合物1能够选择性标记并清晰显示活细胞中LDs的动态变化，特别是在脂质积累过程中。

粘度响应特性

研究人员还探讨了化合物1的荧光强度与微环境粘度的关系。在甲醇-甘油混合体系中，随着甘油比例增加（粘度升高），化合物1的荧光强度逐渐增强，最高可达4.86倍。log(荧光强度)与log(粘度)之间呈现良好的线性关系（R2 = 0.99），表明其可作为粘度变化的敏感指示剂。

在细胞水平，用尼斯特霉素（Nystatin）预处理HeLa细胞以破坏细胞膜并诱导细胞内粘度变化后，再用化合物1孵育。共聚焦成像显示，经尼斯特霉素处理的细胞其荧光强度显著高于未处理对照组，证明化合物1对细胞内的局部微粘度变化同样敏感。

结论

本研究成功开发了一种基于ICT机制的新型脂滴选择性荧光探针（化合物1）。该探针具备合成简便、低细胞毒性、高选择性靶向LDs、对环境极性和粘度变化敏感等突出优点。通过结合先进的光谱技术、细胞成像和理论计算，深入揭示了其光物理机制：溶剂极性通过影响激发态偶极矩和溶剂化能，显著调制其发射行为。在生物应用中，该探针不仅能清晰成像静态和动态（OA诱导）的LDs，还能响应由药物（尼斯特霉素）引起的细胞内微环境粘度变化。因此，化合物1作为一个功能多样的分子工具，在实时监测活细胞脂质代谢、研究脂质相关疾病（如早期肝脂肪变性）及其潜在机制方面展现出巨大的应用前景。