基于PNIPAM的CRISPR/Cas报告系统：革新核酸检测的温敏型均相反应策略

本文推荐一种基于温敏聚合物PNIPAM（聚N-异丙基丙烯酰胺）的CRISPR/Cas报告系统，通过其独特的液相均质反应特性和温度响应相分离能力，显著提升核酸检测灵敏度（LOD达1 fM），克服传统荧光淬灭（FQ）和磁珠（MB）报告系统的局限性，为下一代分子诊断工具开发提供新范式。

　　

亮点

本研究创新性地利用PNIPAM的温敏特性设计CRISPR/Cas报告系统：在低于临界溶解温度（LCST）时保持液相均质反应，显著加速Cas蛋白（如LbuCas13a和Cas12a）的切割动力学；升温后通过相分离实现产物纯化，为超灵敏RNA检测（如SARS-CoV-2）提供全新解决方案。

实验部分

PNIPAM-核酸复合物的构建

如图1A所示，通过一步自由基共聚法合成PNIPAM-核酸复合物。以PNIPAM-12activator DNA为例，紫外光谱（图1B）显示其在260 nm处具有核酸特征吸收峰，证实共聚成功。该设计通过提升局部反应浓度，使切割速率较传统FQ报告系统提高1.5倍以上。

结论

PNIPAM基报告系统不仅兼容多种CRISPR/Cas体系（如Cas12a/Cas13a），其温控相变特性更可联动下游酶级联放大（如HRP/ALP），实现检测灵敏度100倍提升。该技术为即时检测（POCT）和复杂样本分析提供了突破性工具。

作者贡献声明

Xinghu Ji：审校/基金支持；Ziwen Tang：实验设计/数据采集；Zhike He：资源协调/基金支持；其他作者分别参与方法优化、数据验证或设备支持。

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。

数据可用性

数据可根据需求提供。

致谢

感谢中国国家自然科学基金（22174101, 22174102）和武汉大学大型仪器共享平台的资助与技术支持。