鼻粘液钙网蛋白通过TLR2/TLR4信号通路促进中性粒细胞迁移与病原体清除的机制研究

本研究揭示了鼻粘液中钙网蛋白(CALR)通过激活TLR2/TLR4信号通路，促进中性粒细胞跨内皮迁移并增强其杀菌功能的重要机制。研究人员利用山羊鼻黏膜外植体模型，首次发现CALR能通过ICAM-1依赖性途径招募中性粒细胞，并通过Rho GTPases和PI3K/AKT/GSK3β通路激活中性粒细胞释放ROS和NETs，显著加速多杀性巴氏杆菌的清除。该发现为呼吸道黏膜免疫防御提供了新靶点，对开发抗感染策略具有重要指导意义。

　　

呼吸道黏膜的免疫防御新机制

在呼吸系统每日接触大量病原体的环境中，鼻黏膜作为第一道防线，其免疫防御机制备受关注。虽然已知鼻粘液能物理捕获病原体，粘液中的抗菌成分（如乳铁蛋白、溶菌酶等）具有协同杀菌作用，但粘液蛋白如何与免疫细胞协作的分子机制尚不明确。更关键的是，由于人类鼻粘液样本获取困难，相关研究长期受限。这项发表在《Cell Communication and Signaling》的研究，首次揭示了鼻粘液关键成分钙网蛋白(CALR)通过双重机制调控中性粒细胞功能的创新发现。

研究人员采用山羊鼻黏膜外植体模型分离粘液蛋白，通过凝胶过滤色谱和LC-MS/MS鉴定活性成分；利用Transwell迁移实验、GST pull-down和分子对接分析蛋白互作；结合流式细胞术、共聚焦显微镜和Western blot等技术，系统研究了CALR对中性粒细胞迁移、ROS生成及NETs释放的影响；最后通过动物实验验证CALR鼻腔给药对病原体清除的效果。

鼻粘液蛋白促进中性粒细胞抗菌协同作用

通过分离山羊鼻粘液蛋白，发现100 μg/mL总蛋白可使中性粒细胞对多杀性巴氏杆菌的杀灭效率提升40倍。凝胶过滤色谱显示分子量约55 kDa的P4组分促迁移效果最显著，经质谱鉴定为CALR。免疫组化证实CALR在呼吸道区域的分泌随年龄增加。

CALR激活中性粒细胞迁移机制

重组CALR(40 μg/mL)使中性粒细胞迁移增加5倍，并诱导F-actin重构和Rho GTPases（Cdc42/Rac1/RhoA）快速激活。通过RNA-seq和KEGG分析发现TLR信号通路富集，分子 docking 显示CALR的ASP201等残基与TLR2/4形成盐桥。GST pull-down实验证实CALR直接结合TLR2/4，抑制剂实验表明迁移依赖TLR2而非TLR4。

双重通路调控杀菌效应

CALR通过TLR2/TLR4共同激活PI3K/AKT/GSK3β和MAPK通路：TLR2单独调控迁移相关Rho GTPases，而ROS和NETs释放需TLR2/4协同。鼻腔给予CALR后，呼吸道区域中性粒细胞浸润增加3倍，呈现"上皮间散布"、"粘液包裹聚集"和"表面游走"三种形态，肺组织病原体载量降低12.7倍。

这项研究创新性地阐明了鼻粘液CALR通过时空特异性激活TLR信号：一方面通过TLR2-Rho GTPases轴促进跨内皮迁移，另一方面通过TLR2/4-PI3K/MAPK轴增强杀菌功能。这不仅为呼吸道黏膜"化学-免疫屏障"协同机制提供理论突破，更提示CALR可作为增强黏膜疫苗效果的潜在佐剂。鉴于CALR在人类鼻腔中保守表达，该发现为防治流感、结核等呼吸道感染提供了新思路。