高效一锅法连接-脱硫策略实现高产率化学蛋白质合成

这篇研究突破性地开发了利用溴乙酰胺与N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl cysteine）选择性淬灭芳基硫醇（MPAA）的一锅法连接-脱硫技术，解决了传统方法中因芳基硫醇自由基捕获效应导致的纯化瓶颈。通过巧妙利用芳基硫醇与烷基硫醇（peptidic cysteine）的pKa差异，实现了无需中间纯化的高效蛋白质合成，为治疗性蛋白质及生物大分子制备提供了普适性方案。

　　

引言

化学蛋白质合成领域通过固相肽合成（SPPS）与天然化学连接（NCL）技术的结合实现了革命性突破。然而，传统NCL反应依赖的高效芳基硫醇催化剂（如MPAA）会抑制后续自由基介导的脱硫反应，迫使研究人员采用低效烷基硫醇或繁琐的中间纯化步骤。本文提出了一种创新策略，通过溴乙酰胺与N-乙酰半胱氨酸的协同作用，在5分钟内完成MPAA的选择性淬灭，首次实现芳基硫醇催化体系下的一锅法NCL-脱硫反应。

结果与讨论

选择性淬灭机制

研究团队基于芳基硫醇（pK_a≈6.6）与肽链半胱氨酸（pK_a≈8.3）的酸碱度差异，筛选出溴乙酰胺作为最优淬灭剂。实验显示，在pH 6.8条件下，20 mM溴乙酰胺可在5分钟内定量淬灭MPAA，仅产生<2.5%的半胱氨酸烷基化副产物。N-乙酰半胱氨酸的引入进一步通过竞争反应抑制了非特异性修饰，其本身还可作为脱硫反应的烷基硫醇添加剂。

模型肽验证

以Ac-CFRAL-^αCOOH为模型肽的实验中，一锅法策略将脱硫效率从直接反应的5%提升至74%产率，显著优于传统纯化-脱硫流程的54%收率。该方法还成功应用于D-青霉胺（penicillamine）修饰的缬氨酸类似物脱硫，以及超声诱导脱硫（USID）等新兴技术体系。

复杂蛋白质合成

泛素合成

通过两种路线（NaNO₂活化Dbz中间体与Knorr吡唑合成法）分别以74%和67%的收率获得全长泛素蛋白，圆二色谱（CD）证实其正确折叠。

胶原类似物

首次实现六片段一锅法连接-脱硫，43%收率获得99个氨基酸的胶原蛋白，突破了多片段组装的技术瓶颈。

Barstar A功能验证

化学合成的Barstar A（35%收率）通过EtBr-RNA荧光实验证实其能有效抑制barnase核糖核酸酶活性，半数抑制浓度达fM级别，CD谱图与天然构象一致。

结论

该研究建立的芳基硫醇淬灭策略不仅解决了NCL-脱硫反应的技术割裂问题，其操作简便性和普适性为治疗性蛋白质（如抗体、细胞因子）的规模化合成开辟了新路径。未来该技术可拓展至半胱氨酸定点修饰、Acm保护基一锅法去除等蛋白质工程领域。

（注：全文数据与结论均源自原文实验，未添加主观推断）