基于组合式人源转录激活域的高效CRISPR基因激活系统开发与优化

本研究针对CRISPR激活系统中病毒来源转录激活域(TADs)潜在的免疫原性问题，通过系统比较人源TADs（hTADs）的激活效能，开发出NFZ-p65HSF1(NP)等组合式hTADs。这些新型激活域在dCas9/dCasMINI系统中展现出与经典病毒TAD-VPR相当的基因激活效率，同时具有更小的分子尺寸和更低的预测免疫原性，为基因治疗和合成生物学提供了更安全的工具。

　　

基因调控是生命科学的核心问题之一，人工转录因子(ATF)技术的发展为精准操控基因表达提供了强大工具。其中基于CRISPR系统的激活技术(CRISPRa)通过将失活Cas蛋白(dCas)与转录激活域(TAD)融合，实现了对特定基因的上调。然而目前最常用的TADs如VP64、VPR等均含有病毒来源序列，这些外源蛋白可能引发免疫反应，严重阻碍其临床应用。如何开发高效且低免疫原性的人源TADs(hTADs)，成为该领域亟待解决的关键问题。

浙江大学Zehua Bao团队在《Protein & Cell》发表的研究，系统评估了近年来报道的8种hTADs（包括CITED1/2-TAD、MYB-TAD等）的激活效能，发现单一hTADs的活性普遍低于病毒TAD-VPR。通过创新性地构建16种hTAD组合，研究人员发现NFZ-p65HSF1(NP)、CITED2-MSN(CM)等组合在HEK293T、HeLa和人胚胎干细胞(hESCs)中均表现出与VPR相当的激活效率，其中NP对血红蛋白γ基因(HBG)的激活倍数高达55,443倍。更令人振奋的是，这些组合hTADs分子量更小（如CN仅207个氨基酸），且通过dCasMINI系统进一步缩小了载体尺寸。RNA-seq分析证实NP具有与VPR相当的靶向特异性，免疫原性预测显示其含有更少的潜在抗原表位。

关键技术方法包括：1) 构建dCas9/dCasMINI与hTADs的融合表达系统；2) 采用染色体整合EGFP报告基因和qRT-PCR检测内源基因（HBG、IL1B等）的激活效率；3) 通过RNA-seq评估靶向特异性；4) 在HEK293T、HeLa和hESCs等多细胞模型中验证效果；5) 利用免疫原性预测工具分析抗原表位。

hTADs的效能比较

通过质粒和染色体整合的EGFP报告系统，发现p65HSF1、MSN等hTADs的激活效率虽高于VP64，但显著低于VPR。在内源基因HBG、IL1B等位点的激活实验中，hTADs表现出明显的位点依赖性差异。

组合hTADs的工程优化

构建的16种双hTAD组合中，NP(460aa)、CM(355aa)和CP(378aa)在多个基因位点达到或超越VPR(531aa)的激活水平。特别值得注意的是，NP在HBG位点的激活效率是VPR的3倍，且这种优势在hESCs中更为显著。

跨平台兼容性验证

当hTADs与微型化dCasMINI系统融合时，NP仍保持最高激活效率，证明其良好的平台适应性。在酵母异源系统中，NP、CM和CP同样展现出与VPR相当的激活能力。

安全性与特异性评估

RNA-seq数据显示，NP和VPR均主要上调靶基因HBG，非特异性激活基因数分别为120和76个（检测62,704个转录本）。免疫原性分析预测组合hTADs含有更少的9肽抗原表位。

该研究首次系统比较了hTADs的效能差异，并证明通过合理组合可达到病毒TAD的激活水平。开发的NP等组合模块兼具高效性、小型化和低免疫原性优势，尤其NP与dCasMINI的兼容性为体内基因治疗提供了更优解决方案。这些发现不仅丰富了合成生物学工具库，也为基于CRISPRa的临床转化扫除了关键障碍。未来研究可进一步探索这些hTADs在动物模型中的安全性和长效性，推动其向临床应用迈进。