烟草多酚氧化酶基因家族全基因组鉴定及K326烟叶烘烤褐变反应的分子改良

为解决烟草(Nicotiana tabacum L.)叶片烘烤过程中多酚氧化酶(PPO)介导的酶促褐变问题，研究人员通过全基因组挖掘鉴定出13个NtPPO基因，利用CRISPR/Cas9技术构建多基因突变体KO-87。研究发现突变体叶片PPO活性显著降低，烘烤后褐变程度明显减轻，代谢组学分析显示多酚类物质积累而醌类物质减少。该研究为烟草加工过程中的褐变控制提供了分子育种新策略。

　　

烟草作为重要经济作物，其叶片在烘烤过程中常因多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO)催化的酶促褐变导致品质下降。虽然适度褐变能提升烟草香气，但过度褐变会造成外观和营养价值的双重损失。传统抑制PPO活性的物理化学方法存在效率低、残留风险等问题，而基因编辑技术为从根本上解决褐变难题提供了新思路。

研究人员以易褐变品种K326为材料，通过生物信息学分析、基因编辑和代谢组学技术开展研究。主要方法包括：从烟草基因组数据库筛选PPO基因家族成员；利用qRT-PCR分析基因表达模式；通过农杆菌介导法构建CRISPR/Cas9多靶点编辑载体；采用LC-HR-ESI-MS技术进行非靶向代谢组学分析。

研究结果部分：

1. 1.

   鉴定和理化性质分析：从烟草基因组鉴定出13个NtPPO基因，编码蛋白分子量53.03-134.11 kDa，等电点5.89-8.74，均含有酪氨酸酶结构域和跨膜结构。

2. 2.

   进化与保守基序分析：系统发育将NtPPOs分为四类，其中NtPPO2在进化过程中可能发生基因融合事件。保守基序分析发现10个特征性基序，NtPPO8缺失motif5。

3. 3.

   顺式作用元件预测：启动子区分析显示56.5%为光响应元件，其中G-Box出现频率最高（42次），表明NtPPOs表达可能受光照强烈调控。

4. 4.

   组织特异性表达：NtPPO1/3/5/6/7/8/11主要在叶片表达，NtPPO9/10在花中高表达，NtPPO4/12/13在根中优势表达。成熟期叶片中NtPPO1表达量最高。

5. 5.

   亚细胞定位：通过GFP标记证实NtPPO1/6/9/12定位于叶绿体，与PPO在质体中发挥功能的特性一致。

6. 6.

   基因编辑效应：构建的KO-87突变体在NtPPO1/2/4/6/8/9/11/12/13基因位点产生移码突变，叶片PPO活性降低40-60%，烘烤后褐变程度显著减轻。

7. 7.

   代谢组学分析：突变体叶片中黄酮类(如芹菜素-7-O-新橙皮糖苷)等多酚物质显著上调，而醌类代谢物含量下降，证实PPO基因编辑有效阻断了多酚-醌的转化途径。

该研究首次系统解析了烟草PPO基因家族特征，通过多基因编辑策略创制低褐变种质资源。相比传统抑制方法，基因编辑技术能从源头控制PPO活性，且不影响烟草正常生长发育。代谢重编程分析揭示了PPO介导的褐变分子机制，为其他作物采后品质改良提供借鉴。研究成果发表于《Industrial Crops and Products》，对提升烟草工业价值和拓展基因编辑应用具有重要意义。