高效棉花子叶原生质体瞬时转化系统的开发及其在功能基因组学和基因编辑中的应用

本研究针对棉花基因功能验证中传统遗传转化方法耗时低效的瓶颈，开发了基于黄化子叶原生质体的高效瞬时转化系统(CPT)。通过优化酶解配方(1.5%纤维素酶+0.75%离析酶+1%半纤维素酶)和转化条件(40% PEG4000+15μg质粒+15min孵育)，实现原生质体产量4.6×106·g-1、存活率95%、转化效率71.47%。该系统成功应用于亚细胞定位、双分子荧光互补(BiFC)和prime editing载体验证，为棉花功能基因组研究和基因编辑技术开发提供了重要平台。

　　

棉花作为全球最重要的天然纤维作物，其基因组研究已构建了与农艺性状相关的精英基因库。然而，基因功能验证却受限于传统遗传转化方法——愈伤组织转化需9-10个月，茎尖转化虽快但嵌合体难以筛选。这种技术瓶颈严重阻碍了棉花功能基因组学研究和分子育种进程。

为解决这一难题，WANG Zhicheng等研究人员在《Journal of Cotton Research》发表研究，开发了基于黄化子叶原生质体的高效瞬时转化系统(CPT)。该系统通过创新性地使用黑暗培养的黄化子叶作为材料，结合优化的酶解体系，大幅提升了原生质体的产量和质量。研究人员系统考察了纤维素酶、离析酶和半纤维素酶的不同配比，最终确定1.5%纤维素酶+0.75%离析酶+1%半纤维素酶的组合可在5小时内获得4.6×10⁶·g^-1的高产量原生质体，且存活率达95%。

在转化条件优化方面，研究团队创造性地建立了"四因素优化模型"：针对质粒大小(4-15kb)、用量(8-19μg)、PEG浓度(10%-60%)和孵育时间(5-20min)进行系统测试。结果显示15μg质粒、40% PEG4000浓度和15分钟孵育时间的最佳组合，使转化效率突破性达到71.47%，较传统方法提升7倍。

关键技术方法包括：黄化子叶原生质体制备、PEG-Ca²⁺介导的瞬时转化、荧光显微镜检测、双分子荧光互补(BiFC)分析以及prime editing载体构建与验证。实验材料采用陆地棉(Gossypium hirsutum L. acc. TM-1)成熟种子培育的黄化子叶。

Development of a method to extract protoplast from cotton cotyledons

研究发现黄化子叶比正常光照子叶更适合作原生质体材料，酶解更快且纯度更高。通过比较不同酶组合，确定1.5%纤维素酶+0.75%离析酶+1%半纤维素酶的组合在5小时消化时间内可获得最佳产量(4.6×10⁶·g^-1)和活力(95%)。

Optimization on protoplast-based transient transformation

转化系统优化显示：质粒大小与转化效率呈负相关，但可通过增加质粒量补偿；40% PEG4000浓度和15分钟孵育时间达到最佳平衡，使pRI101-GFP载体转化效率达71.47%，较初期的10%显著提升。

Utility of cotton CPT

该系统成功应用于：1)核定位蛋白GhMYB2的亚细胞定位；2)GhSP2与GhFL蛋白相互作用的BiFC验证；3)prime editing载体功能测试。特别是双载体共转化实验证实了系统的多重基因分析能力。

Fast and efficient validation of prime editing vectors using cotton protoplast

虽然prime editing在GhMYC2-like靶点的编辑效率仅0.28%，但首次证实了prime editing系统在棉花原生质体中的可行性，为后续优化奠定了基础。

这项研究建立的CPT系统具有三大突破性意义：首先，将棉花基因功能验证周期从数月缩短至数天；其次，71.47%的转化效率达到植物原生质体转化的国际先进水平；最重要的是，该系统成功整合了从基础基因功能研究(亚细胞定位、蛋白互作)到前沿基因编辑技术(prime editing)的全链条验证平台。

特别值得注意的是，研究团队创新性地采用黄化子叶作为材料，解决了棉花原生质体产量低的难题；而建立的"四因素优化模型"为其他作物原生质体转化系统开发提供了重要参考。该系统不仅加速了棉花功能基因组研究，更为CRISPR-Cas9、base editing等新兴基因编辑技术在棉花的应用建立了快速验证通道，对推进棉花分子设计育种具有重要价值。