CrispHunter系统化crRNA设计与结构优化发夹探针协同增强CRISPR-Cas12a检测类鼻疽伯克霍尔德菌的灵敏度

本研究创新性整合CrispHunter生物信息学管道与结构优化分子信标（MB），开发出针对高遗传多样性病原体（如类鼻疽伯克霍尔德菌）的CRISPR-Cas12a检测平台。通过全基因组分析筛选12个保守crRNA，结合五联crRNA策略将检测限（LOD）降至7.5 pM；优化的S5L8发夹探针使无扩增LOD达2.1 pM，信噪比提升42倍，配合重组酶聚合酶扩增（RPA）更可实现14.82拷贝/μL的超高灵敏度，为复杂病原体诊断提供模块化解决方案。

　　

Highlight

CrispHunter赋能精准crRNA设计用于类鼻疽伯克霍尔德菌检测

类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei）的全球菌株存在显著基因组多样性，传统检测方法易受干扰。为此我们开发了CrispHunter——一个通过自动化全基因组分析实现高精度crRNA筛选的生物信息学管道。该工具系统检索目标物种所有可用基因组，识别所有菌株共有的核心基因，并针对这些高度保守区域设计候选crRNA。每个crRNA均需通过严格评估：要求实现100%菌株覆盖且脱靶效应最小，最终从3245个公开基因组中锁定12个最优crRNA靶点。

讨论

本研究提出的CrispHunter通过自动化、可扩展的生物信息学流程，成功解决了CRISPR-Cas12a诊断中基因组多样性与检测覆盖率的难题。不同于依赖单一参考基因组的传统设计工具，CrispHunter能对目标生物所有可用基因组进行全景分析，其适用范围涵盖细菌、病毒乃至真核病原体。特别值得注意的是，我们开发的五联crRNA策略通过协同作用将Cas12a活性提升3.8倍，这种多靶点协同激活机制为突破现有检测灵敏度瓶颈提供了新思路。

结论

基于CrispHunter管道构建的CRISPR-Cas12a平台，采用精准导向的多crRNA策略攻克了类鼻疽伯克霍尔德菌遗传多样性带来的检测难题。搭载工程化S5L8信标使无扩增检测限达到2.1 pM，结合RPA扩增后灵敏度更跃升至14.82拷贝/μL。为确保平台持续有效性，CrispHunter的预测能力将通过定期纳入新测序基因组数据不断强化，这种动态优化机制使其成为应对病原体快速进化的有力武器。