结构导向的I-F型CRISPR相关转座酶工程改造实现人类细胞靶向基因插入

本研究针对传统基因组编辑工具依赖DNA双链断裂(DSBs)导致的异质性结果问题，通过冷冻电镜解析PseCAST QCascade复合物结构，揭示了RNA-DNA异源双链特征及亚型特异性相互作用。研究人员结合结构数据与理性设计，开发出整合效率提升3.5倍的Cas8变体，并构建了首例I-F/V-K型嵌合CAST系统，为人类基因组工程提供了新型DSB-free大片段插入工具。该成果发表于《Nature Communications》，为基因治疗载体构建等应用开辟了新途径。

　　

基因组编辑领域长期面临DNA双链断裂(DSBs)引发的染色体异常和插入片段尺寸受限等瓶颈。虽然CRISPR相关转座酶(CAST)系统能实现无DSB的大片段插入，但I-F型PseCAST在人类细胞中的低效率成为应用障碍。George D. Lampe团队在《Nature Communications》发表的研究，通过结构生物学与蛋白质工程相结合的策略，揭示了制约CAST效率的关键因素并实现系统性优化。

研究采用冷冻电镜单颗粒分析技术解析PseCAST QCascade复合物的3.0?结构，发现其Cas8蛋白PAM识别区存在独特的丙氨酸残基(A243/A244)，这解释了该系统的宽松PAM偏好性。通过构建15种Cas8变体，发现A244S突变使基因组插入效率提升3.5倍。在RNA-DNA异源双链区域，研究捕捉到Cas7"手指"基序导致的非理想碱基配对构象，但突变实验证实这些构象对复合物稳定性至关重要。

研究的关键技术包括：冷冻电镜结构解析、AlphaFold-Multimer预测TnsABC复合物结构、HEK293T细胞基因组整合效率检测、大肠杆菌转录抑制筛选系统等。通过整合这些技术，团队不仅阐明了CAST工作机制，还开发出创新工程策略。

【CryoEM结构揭示PseCAST靶向机制】

2.6?分辨率的冷冻电镜结构显示，PseQCascade包含六聚体Cas7形成的伪螺旋结构，其TniQ二聚体与Cas6/Cas7.6形成四重接口。与VchCAST相比，PseCAST的crRNA核苷酸G41采取独特外翻构象，成为TniQ.1/TniQ.2/Cas7.6相互作用的枢纽。

【PAM识别区工程改造】

通过比较I-F型CAST同源物，发现PseCas8缺乏极性残基的PAM结合口袋。将A243/A244突变为丝氨酸等极性氨基酸后，虽然未增强PAM严格性，但Cas8^A244S变体表现出最高整合效率，表明DNA结合稳定性与效率存在复杂关联。

【嵌合CAST系统构建】

基于AlphaFold预测的TnsB C端"钩状"结构，团队成功将PseCAST转座模块与VchCAST靶向模块组合，创建出功能性嵌合系统。其中移植29个氨基酸的嵌合体在大肠杆菌中实现10%整合效率，并首次实现I-F型与V-K型CAST的跨亚型协作。

研究结论指出，PseCAST的低DNA结合活性可能源于自然选择压力——为避免靶向宿主必需基因而演化的弱结合特性。通过结构指导的理性设计，不仅提升了I-F型CAST在人类细胞中的效率，更开创了模块化工程策略，使不同CAST亚型的优势组件得以组合。这种"混合匹配"方法突破了自然进化的限制，为开发下一代基因组编辑工具提供了新范式。

讨论部分强调，该研究首次在原子水平揭示了I-F3亚型CAST的结构特征，其发现的Cas7介导的RNA-DNA异源双链扭曲机制，为理解CRISPR系统靶标识别提供了新视角。所开发的嵌合CAST技术平台，使得研究人员能像"拼装乐高积木"般组合不同来源的功能模块，这将加速治疗性基因递送系统的开发进程。