基于棉子糖辅助的一锅式LAMP-CRISPR/Cas12b微流控技术实现植物病毒六样本并行检测

为解决植物病毒现场快速检测难题，研究人员开发了ALERT平台，整合RT-LAMP与CRISPR/Cas12b技术，通过棉子糖实现一锅式反应相分离，结合微流控芯片实现六样本并行检测。该平台灵敏度与RT-PCR相当，现场检测准确率达100%，为资源有限地区提供便携高效的病毒诊断工具。

　　

植物病毒病害每年造成全球农作物产量损失高达数百亿美元，但传统检测方法如RT-PCR依赖实验室设备，难以在田间实施。尽管等温扩增技术(LAMP)简化了操作，但假阳性率高；CRISPR/Cas系统虽能精准识别病毒核酸，但多步骤操作易导致污染。如何实现高灵敏度、便携式且可并行的现场检测，成为植物病毒防控的卡脖子问题。

这项发表于《Journal of Advanced Research》的研究，由中国甘肃农业大学团队开发了ALERT平台（AapCas12b coupled RT-LAMP Extraction-field RNA testing）。关键技术包括：1) 基于3D打印的微流控芯片设计，集成特斯拉阀防止逆流；2) 棉子糖辅助的一锅式LAMP-CRISPR/Cas12b反应体系，通过密度差异实现动态扩散；3) 便携式恒温器（57±3°C）与硅胶膜核酸快速提取法；4) 使用24份田间辣椒样本验证性能。

结果部分

平台设计：微流控芯片直径60mm，含6个反应腔室，通过8°倾斜通道促进液体流动。便携孵化器采用Type-C供电，功率15W，温度波动±3°C。

优化验证：5%棉子糖使LAMP产物扩散效率提升3倍（对比蔗糖），在57°C下荧光信号最强。体积比2:1（LAMP:CRISPR）时灵敏度达100 fg/μL，与RT-PCR相当。

田间检测：对甘肃6地区24份样本检测显示，BWYV检出率25%（6/24），与qRT-PCR结果一致。硅胶膜核酸提取法较传统方法信号强度提高40%。

讨论与意义

该研究突破性地解决了LAMP与CRISPR系统兼容性问题：棉子糖通过氢键网络促进扩增产物向CRISPR区扩散，而3D打印芯片的PEG涂层（2%）增强了生物相容性。相比已有技术，ALERT将检测成本控制在12.06美元/样本，时间缩短至1小时，尤其适合发展中国家农业现场应用。

局限性在于Cas12b耐热性不足限制反应温度提升，未来可通过酶工程改造优化。研究者建议将芯片-加热器集成封闭式设计以抵御风沙干扰，这一创新为植物检疫和疫情早期预警提供了颠覆性工具。