综述：多维策略提升黑曲霉异源蛋白高效表达

本综述系统阐述了利用合成生物学工具（如CRISPR-Cas9/Cas12）和代谢工程策略优化黑曲霉（Aspergillus niger）异源蛋白生产的五维路径：表达系统（动态启动子、表观修饰）、分泌途径（信号肽工程、ER-Golgi优化）、代谢通量（糖酵解/TCA循环节点调控）、智能发酵（两阶段培养、在线传感）及多组学整合（基因组-转录组机器学习分析），为GRAS微生物底盘细胞构建提供新思路。

　　

基因编辑与表达系统优化

CRISPR-Cas9和Cas12系统通过多靶点编辑和多拷贝整合策略显著提升黑曲霉的基因表达效率。合成生物学工具如动态诱导型强启动子（如PgpdA和Ptef1）实现了基因表达的时空控制，而组蛋白修饰（H3K4me3和H3K27ac）的表观遗传调控揭示了染色质状态对异源蛋白产量的影响。

分泌途径与蛋白质质量控制

当基因表达效率提升后，分泌瓶颈成为关键挑战。研究采用信号肽工程（如α-淀粉酶信号肽变体）优化蛋白质转运，通过内质网（ER）伴侣蛋白（BiP和PDI）过表达减少错误折叠，并调控细胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶基因（fksA）以增强分泌通量。

糖酵解与TCA循环的节点调控

定向改造碳代谢网络可大幅提升底物转化率。例如，过表达磷酸果糖激酶（PfkA）和丙酮酸激酶（PkiA）使糖酵解通量提升40%，而柠檬酸合酶（gltA）的敲除将碳流导向目标蛋白合成。动态调控策略如葡萄糖感应器（Snf1）的工程化进一步平衡了生长与生产阶段的需求。

智能发酵与跨物种协同

两阶段发酵策略通过在线传感器（如pH和DO探头）实时调整参数，将菌体生长与产物合成解耦。基因编辑增强胁迫抗性（如氧化应激基因rscI的过表达），而共培养系统（如与酿酒酵母协同）可解除代谢副产物抑制。

多组学驱动的系统生物学优化

整合基因组、转录组和蛋白组数据，机器学习算法（如支持向量机）预测关键调控靶点。动态代谢通量分析（¹³C标记）揭示了糖酵解与蛋白分泌的偶联机制，而全基因组规模模型（GSMM）指导了理性设计。

结论与展望

当前挑战包括宿主-蛋白适配性差和规模化放大效应。未来需开发通用型底盘细胞库，结合自动化筛选（微流控芯片）和AI驱动的闭环优化，实现黑曲霉异源蛋白生产的工业化应用。