紫花苜蓿MsWOX13-2基因下调通过增强抗氧化与光合效率提升耐涝性的分子机制

本研究首次揭示紫花苜蓿（Medicago sativa）WUSCHEL-related homeobox（WOX）转录因子家族成员MsWOX13-2作为耐涝性负调控因子的功能机制。通过RNAi沉默和CRISPR/Cas9基因编辑技术证实，MsWOX13-2下调可显著提高叶绿素保留率（Fv/Fm）、超氧化物歧化酶（SOD）活性，并通过调控抗氧化（H2O2）、光合作用及发酵相关基因表达，为牧草抗逆育种提供新靶点。

　　

研究背景

随着气候变化导致全球涝渍事件频发，紫花苜蓿作为重要牧草面临严重生产威胁。该研究聚焦WUSCHEL-related homeobox（WOX）转录因子家族中功能未知的MsWOX13-2基因，其在涝渍胁迫21天后表达显著下调13倍，暗示其可能参与应激响应。

基因特征与表达模式

MsWOX13-2在四倍体紫花苜蓿基因组中存在4个等位基因，编码含64-131位氨基酸同源域的蛋白。组织特异性分析显示，该基因在根中表达最高，但根瘤中显著降低。值得注意的是，在野生型植株中，涝渍处理三周后叶片MsWOX13-2转录水平急剧下降，而短期处理（1-14天）无显著变化。

遗传修饰与表型验证

通过RNAi技术构建的转基因株系（RNAi-203/205）实现MsWOX13-2表达量最高下调17倍，且不影响其旁系同源基因MsWOX13-1的表达。表型分析发现：

1. 1.

   耐涝性增强：RNAi株系在14天涝渍后存活率达62-70%，显著高于空载体对照（27%）。

2. 2.

   光合维持：胁迫下RNAi株系叶绿素含量比对照高2倍，最大光量子效率（F_v/F_m）下降幅度更小。

3. 3.

   氧化损伤减轻：DAB染色显示空载体植株H₂O₂积累显著，而RNAi株系丙二醛（MDA）含量降低64%。

生理与分子机制

抗氧化系统：RNAi株系SOD活性提升80-141%，且SOD（Fe/Mn/Cu-Zn）编码基因显著上调。但抗坏血酸过氧化物酶（APX）和过氧化氢酶（CAT）活性未受影响，暗示过氧化物还原酶等其他途径参与H₂O₂清除。

代谢重编程：

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  糖代谢：糖酵解途径40/54差异基因上调，包括磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）等关键酶。

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  发酵途径：乳酸脱氢酶（LDH）和乙醇脱氢酶（ADH）基因表达增强，但丙酮酸脱羧酶（PDC）下调。

转录组学：WGCNA分析揭示"blue模块"（光合/氧化还原相关基因）在RNAi株系中受抑制程度更低，而"midnightblue模块"（核调控基因）特异性激活。

植物激素：

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  乙烯合成基因（ACS/ACO）在RNAi株系中下调

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  脱落酸（ABA）通路基因（如玉米黄质环氧化酶）显著上调

CRISPR/Cas9验证

双等位突变体（CRISPR-5/11）在靶位点产生6-30bp缺失，导致蛋白截短。经21天涝渍处理后，编辑株系存活率（62.5-100%）显著高于对照（41.67%），且叶片黄化症状更轻，证实MsWOX13-2功能缺失可增强耐涝性。

应用前景

该研究首次阐明WOX13亚族在植物涝渍响应中的负调控作用，为牧草抗逆育种提供分子靶点。未来可通过基因编辑技术创制MsWOX13-2低表达材料，或利用其调控网络开发分子标记，助力气候变化下的可持续牧草生产。