CRISPR/Cas9双基因敲除Tk1-SST和Tk1-FFT显著提升蒲公英橡胶草天然橡胶积累的分子机制研究

本研究通过CRISPR/Cas9技术同步敲除蒲公英橡胶草（TKS）菊糖合成关键基因Tk1-SST和Tk1-FFT，首次创制菊糖合成缺陷型双基因纯合突变体1-sst1-fft。该突变体菊糖合成被完全抑制，蔗糖含量显著提升，驱动天然橡胶（NR）积累翻倍且分子量（Mn/Mw）不变，同时植株生物量、开花数和结实率显著增加。转录组分析揭示蔗糖代谢（SPS/INV）、糖信号转导（HXK1/SnRK1/TOR）和橡胶延伸（CPT/CPTL）通路基因协同上调，为橡胶草高产育种提供了创新策略。

　　

引言

菊糖作为（2,1）-连接的果聚糖，是菊科植物重要的储备碳水化合物，其合成由蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶（1-SST）和果聚糖:果聚糖1-果糖基转移酶（1-FFT）催化。俄罗斯蒲公英（Taraxacum kok-saghyz, TKS）根部可同时合成高分子量天然橡胶（NR）和菊糖，但菊糖含量（25%-40% DW）远高于NR（3%-28% DW），两者存在碳源竞争。前期研究发现抑制菊糖降解酶1-FEH可提升NR含量，但菊糖合成通路关键基因的遗传调控机制尚不明确。

结果

双基因纯合突变体的创制

研究团队从TKS 1152品系克隆获得Tk1-SST和Tk1-FFT基因（均含7个外显子），针对保守性最高的第三外显子设计sgRNA（SST-T1/T2和FFT-T1/T2），构建Ubiquitin启动子驱动的CRISPR/Cas9载体。通过根段农杆菌转化获得119株T₀代植株，Hi-TOM测序鉴定出5株双基因纯合突变体1-sst1-fft（ssff-10/17/22/36/43），突变效率达4.2%。Western blot证实突变体根部完全缺失Tk1-SST和Tk1-FFT蛋白表达，qPCR显示基因表达量仅为野生型（WT）的0.17%-9.1%。通过组培扩繁和杂交回交，证实突变位点可稳定遗传至T₂代，且与参考基因组比对未发现脱靶效应。

表型与代谢重塑

1-sst1-fft突变体表现出显著增强的营养生长：莲座叶数增加1.77-1.96倍，叶面积扩大74.1%-89.0%，地上部鲜重提升2.62-3.09倍。二次开花期单株花量增加2.29-2.88倍，正常种子数提高1.76-2.45倍。根部菊糖含量骤降至WT的0.81%-1.34%（180.96→1.47-2.43 mg/g DW），聚合度（DP）从11.5降至2.1-3.3。GC/MS检测显示突变体根部蔗糖含量持续增加（较WT高33%-125%），而果糖含量降低，淀粉含量减少14.5%-25.7%。值得注意的是，NR含量在突变体中翻倍（最高达123.95 mg/g DW），但分子量（M_w=1.02-1.12×10⁶ Da，M_n=2.98-3.45×10⁵ Da）与WT无显著差异。油红O染色显示突变体乳管细胞密度和直径显著增加。

分子机制解析

转录组分析鉴定出8335个差异基因（DEGs），其中蔗糖磷酸合成酶（SPS）和转化酶（INV）基因表达上调2.1-5.8倍，酶活检测证实其活性显著增强。糖信号通路关键元件己糖激酶（HXK1）、SnRK1和TOR激酶表达量提升，7个SWEET糖转运体基因同步上调。橡胶生物合成通路中，MEP途径的CMS2和HDR5基因表达增强，而MVA途径的HMGR2/4/5下调但酶活未变。尤为关键的是，橡胶延伸核心基因CPT4（表达量提升8.13倍）及其激活因子CPTL1（上调2.06倍）显著激活，橡胶粒子结构蛋白SRPP4/10/11同步上调。UPLC-MS/MS检测发现16种萜类化合物（含5种增幅超5倍的倍半萜和三萜）积累增加，与蔗糖含量呈正相关（p<0.01）。

讨论

本研究首次在植物中实现1-SST/1-FFT双基因敲除，揭示菊糖合成缺陷导致碳源重新分配的三重效应：①通过上调SPS/INV-SWEET模块增强蔗糖合成与转运；②激活HXK1-TOR信号通路促进光合产物向地上部分配；③通过CPT/CPTL-SRPP网络驱动碳源向NR生物合成流动。不同于单基因突变体，双敲除彻底阻断菊糖合成，使NR产量突破性提升。该策略避免了外源基因导入，为TKS分子设计育种提供了新思路，其"减菊糖增橡胶"模式对银胶菊等产胶植物具有重要借鉴意义。未来研究可结合乳管分化调控因子（如JA/PSK）进一步优化橡胶产量与品质。

（注：全文严格遵循原文数据，未添加未提及的结论，专业术语均标注英文缩写并保留上下标格式，去除了文献引用标记）