通过双敲除DYRKP1激酶与ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）增强莱茵衣藻脂质积累的代谢工程研究

本研究针对微藻生物燃料生产中碳分配效率低的问题，通过CRISPR-Cas9技术对莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）进行DYRKP1激酶与AGP基因的双敲除（dKO），成功将淀粉合成通路的碳流重定向至脂质合成。结果显示，dKO突变体在氮缺乏条件下总脂肪酸（TFA）含量较亲本株提高2.4倍，且C16:0和C18:1等生物柴油关键组分显著增加。该研究为微藻代谢网络的层级调控机制提供了新见解，发表于《Microbial Cell Factories》。

　　

研究背景与科学问题

微藻作为"绿色细胞工厂"，其将CO₂转化为生物燃料的潜力备受关注。然而，细胞内碳流在淀粉和脂质间的自然分配效率低下，成为产业化的主要瓶颈。传统策略如敲除淀粉合成关键酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）虽能提高脂质产量，但常伴随生长抑制。2016年，法国团队在细胞壁完整的莱茵衣藻137AH株中发现，植物特异性DYRKP1激酶缺失会导致淀粉超积累，但其在无细胞壁株系中的代谢调控机制尚不明确。更关键的是，DYRKP1与AGP的双重调控能否产生协同效应，仍是未解之谜。

关键技术方法

研究采用细胞壁缺失株CC4349为亲本，通过CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合体（RNP）构建DYRKP1单敲除（三株独立突变体）及DYRKP1-AGP双敲除（dKO）突变体。通过Neubauer计数室进行生长分析，淀粉含量采用淀粉酶-葡萄糖氧化酶法测定，总脂肪酸（TFA）通过GC-FID分析脂肪酸甲酯（FAME），光合参数通过Dual-PAM100测量。所有实验均在自养（MM-MOPS+2% CO₂）和混养（TAP+乙酸）条件下平行开展。

主要研究结果

1. 1.

   DYRKP1缺失的代谢表型具有营养依赖性

   在混养条件下，DYRKP1敲除株淀粉含量较亲本提高40%（p<0.005），但自养条件下反而降低。有趣的是，无论氮充足与否，突变体总脂肪酸（TFA）均增加25-40%，且C16:0和C18:2 cis(n6)等生物柴油关键组分显著富集。

1. 1.

   双敲除未产生预期协同效应

   dKO突变体TFA含量虽比亲本高2.4倍，但仅比AGP单敲除株高1.2倍。脂肪酸组成分析显示，dKO突变体C16:0和C18:1 trans(n9)增加，但C18:3n3等多不饱和脂肪酸减少，表明碳流重定向存在代谢瓶颈。

2. 2.

   细胞壁状态决定代谢重编程

   对比137AH（有壁）和CC4349（无壁）背景的DYRKP1突变体发现：前者淀粉积累达亲本4倍且伴随活性氧（ROS）爆发，后者无此现象。转录组数据显示，137AH背景突变体中过氧化物酶体（Mn-SOD等）表达上调，提示细胞壁降解障碍可能通过ROS间接影响碳分配。

结论与意义

该研究首次揭示DYRKP1在无细胞壁微藻中的代谢调控具有营养模式特异性，其与AGP的双敲除虽能提高脂质产量，但未实现理论预期的协同效应。这一发现暗示：当关键代谢瓶颈（如AGP）已被解除时，上游调控因子（如DYRKP1）的修饰可能收益递减。研究为理解微藻碳分配的层级调控提供了新视角，未来需结合转录因子工程（如bZIP1/MYB1）和动态调控策略，才能突破现有代谢工程的天花板。