机器学习辅助的CRISPR/Cas12a与滚环扩增联用比率型双模式平台实现microRNA-33超灵敏检测

本文推荐一种创新性检测平台：通过整合滚环扩增（RCA）与CRISPR/Cas12a反式切割活性，结合MnO2纳米片催化OPD产生双荧光信号（430/558 nm）及显色反应，建立机器学习辅助的比率型双模式检测体系。该技术突破传统单信号检测局限，实现冠状动脉疾病标志物miRNA-33的fM级检测（LOD=4.6 fM），兼具抗干扰性强、操作简便等优势，为心血管疾病早期诊断提供新工具。

　　

Highlight亮点设计

该比率型荧光传感平台巧妙融合CRISPR/Cas12a系统与滚环扩增（RCA）技术（如Scheme 1所示）。当靶标miRNA-33触发RCA反应后，产生的串联DNA重复序列会激活Cas12a/crRNA复合物的反式切割活性，进而特异性剪切磁珠表面生物素标记的单链DNA。通过磁性分离，释放的碱性磷酸酶（ALP）可催化MnO₂ NS介导的邻苯二胺（OPD）氧化反应，同步产生从黄色到蓝色的肉眼可见显色变化，以及430 nm到558 nm的荧光位移。这种原位生成双信号的设计无需预先合成荧光探针，大幅降低背景干扰。

Preparation of MnO₂ NS纳米片制备

参照经典方法：将0.3 M MnCl₂·4H₂O溶液与0.6 M四甲基氢氧化铵（TMA·OH）、30% H₂O₂按比例混合，超声处理2分钟后25℃搅拌过夜。离心收集的MnO₂纳米片经水/甲醇交替清洗后，60℃真空干燥备用。该纳米材料具有优异的催化活性和表面可调性，是实现比率检测的核心元件。

Design strategy设计策略

如Scheme 1所示，5'端巯基修饰、3'端生物素标记的S-DNA通过25个胸腺嘧啶碱基锚定在氨基化磁珠上，再通过链霉亲和素-生物素相互作用连接ALP-SA。当miRNA-33与环形模板杂交启动RCA反应时，生成的超长单链DNA产物可激活Cas12a的"分子剪刀"功能，剪切磁珠表面的S-DNA-ALP复合物。释放的ALP催化2-磷酸抗坏血酸三钠盐转化为抗坏血酸（AA），进而还原MnO₂ NS并氧化OPD，产生双模式信号输出。该设计通过荧光比率（F₅₅₈/F₄₃₀）与比色信号的相互校正，显著提升检测可靠性。

Conclusion结论

本研究构建的RCA-CRISPR/Cas12a联用平台，通过机器学习算法解析双模式信号，实现对miRNA-33的超灵敏检测。相较于传统PCR技术，该方法省略热循环步骤，在血清样本中展现卓越的抗干扰能力。特别是MnO₂ NS介导的原位信号生成机制，既避免复杂探针合成，又通过比率测量消除环境因素干扰，为心血管疾病POCT诊断提供创新解决方案。