CRISPR-Cas12a与RAA联用可视化技术：马链球菌马亚种快速检测新策略

（编辑推荐）本研究创新性整合重组酶辅助扩增(RAA)与CRISPR-Cas12a技术，针对马链球菌马亚种(S.equi)的eqbE基因建立可视化检测平台。该方案在37°C恒温条件下50分钟内完成检测，灵敏度达5.6×100拷贝/μL，临床验证显示97.14%特异性和100%敏感性，为马腺疫(Strangles)的现场诊断提供突破性解决方案。

　　

【研究背景】

马腺疫(Strangles)作为全球性马属动物传染病，其病原体马链球菌马亚种(Streptococcus equi subspecies equi, S.equi)可通过直接接触或环境污染物传播。该病原在环境中存活时间差异显著（1-3天至4-6周），且康复马匹仍具6周以上传播风险。传统哥伦比亚血琼脂培养法易与马链球菌兽疫亚种(S. zooepidemicus)混淆，而SeM蛋白iELISA试剂盒难以检出潜伏期及康复期感染。实时定量PCR虽精确但依赖昂贵设备，制约其在牧场现场的应用。

【技术突破】

研究团队开创性构建"管中管"检测体系：

1. 1.

   引物设计：基于14株S.equi的eqbE基因保守区，通过Geneious 9.0.2比对筛选出最佳引物对F2R1（300bp扩增片段）

2. 2.

   体系优化：

   • •

     crRNA筛选：5种设计中crRNA4显示最强荧光信号（P<0.001）

   • •

     反应条件：60nM Cas12a+60nM crRNA+300nM ssDNA报告分子

   • •

     时间控制：25分钟RAA扩增+30分钟CRISPR切割

3. 3.

   创新设计：将RAA反应液置于管底，CRISPR体系预装管盖，离心混合避免开管污染

【性能验证】

1. 1.

   灵敏度：可检出低至5.6拷贝/μL的标准质粒，较常规qPCR提升10倍

2. 2.

   特异性：对马流感病毒(H3)、马疱疹病毒1/4型等7种病原体无交叉反应

3. 3.

   临床测试：48份疑似样本检测显示与qPCR结果97.9%一致（κ=0.95），ROC曲线下面积0.9857

【应用前景】

该平台突破性实现：

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  设备简化：仅需便携式UV灯（420-700美元）替代数万美元qPCR仪

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  成本优势：单次检测3.6-4.1美元，较传统方法降低60%现场部署成本

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  操作便捷：50分钟完成从采样到结果判读的全流程

【局限与改进】

当前体系存在约2.86%假阳性率（1/35），推测源于RAA气溶胶污染。未来可通过冻干试剂开发及微流控芯片集成进一步提升稳定性。该技术路线为牛结核、禽流感等动物疫病的现场检测提供了可复用的技术框架。

注：所有数据均来自原文实验验证，技术参数经单因素优化（OFAT）确定，统计学处理采用GraphPad Prism 9.5.1完成，显著性标记遵循*P<0.001标准。