新型SHERLOCK技术检测生殖支原体的开发与临床评估：迈向即时诊断的突破

这篇研究开发了基于CRISPR-Cas13a和重组酶聚合酶扩增（RPA）的SHERLOCK技术，靶向生殖支原体（MG）的Mg219基因，实现1小时内高灵敏度（10拷贝/反应）检测。通过128例临床尿液样本验证，与cobas TV/MG检测一致性达91.4%，为性传播感染（STI）的即时诊断（POCT）提供新工具。

　　

ABSTRACT

生殖支原体（Mycoplasma genitalium, MG）是导致性传播感染的重要病原体，与男性尿道炎、前列腺炎及女性宫颈炎相关。传统核酸扩增检测（NAATs）虽为金标准，但依赖复杂设备。本研究开发了一种基于特异性高灵敏度酶报告解锁（SHERLOCK）技术的检测方法，结合等温RPA扩增与CRISPR-Cas13a反应，靶向MG的保守基因Mg219，实现60分钟内可视化结果判读。

INTRODUCTION

MG的诊断面临培养困难（需6个月以上）和血清学交叉反应等挑战。现有商业检测如cobas TV/MG（靶向多拷贝mgpB基因）虽灵敏度高（85-100%），但设备要求限制了即时应用。SHERLOCK技术通过37°C等温反应和横向流动检测，为资源有限场景提供解决方案。

MATERIALS AND METHODS

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  样本处理：128例疑似MG尿道炎男性患者的首段尿液，经离心和粗提DNA后用于检测。

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  引物设计：通过Primer3优化RPA引物，Cas13Design设计crRNA，靶向Mg219（GenBank NC_000908.2）。

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  反应体系：RPA扩增后，Cas13a切割FAM标记的RNA探针，通过横向流动试纸条（金纳米壳标记）实现裸眼判读。

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  灵敏度与特异性：检测限达10拷贝/反应，且与48种病原体（包括肺炎支原体）无交叉反应。

RESULTS

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  临床性能：与cobas TV/MG相比，阳性符合率79.6%（95% CI: 66.4–89.3%），阴性符合率100%。

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  对比qPCR：SHERLOCK阳性样本的qPCR拷贝数中位数显著更高（2,250 vs. 0拷贝/mL，P<0.001），提示对低载量样本的局限性。

DISCUSSION

SHERLOCK的优势在于：

1. 1.

   快速简便：粗提DNA兼容性良好，无需纯化步骤。

2. 2.

   高特异性：Mg219靶点避免与其他支原体交叉反应。

3. 3.

   成本效益：横向流动检测降低设备依赖。

   局限性包括对低载量样本（如无症状感染者）的灵敏度不足，未来需优化单步反应流程和自动化判读设备。

CONCLUSION

本研究证实SHERLOCK技术可作为MG即时诊断的有力工具，尤其适用于基层医疗。后续需扩大样本类型（如阴道拭子）和前瞻性临床验证以推动转化应用。

ACKNOWLEDGMENTS

感谢日本国家生物资源项目（NBRP）和埼玉医科大学医院的资助支持。