辣椒和本氏烟原生质体高效瞬时表达系统的建立与应用

为解决辣椒(Capsicum annuum)和本氏烟(Nicotiana benthamiana)原生质体PEG介导转化效率低、操作复杂的问题，研究人员开发了一种基于农杆菌(Agrobacterium)浸润的瞬时表达系统。通过优化原生质体分离方法（Method I/II），实现了75.33%的高效转化，并成功应用于亚细胞定位（CaP24δ3-内质网）、蛋白互作（BiFC/Split-LUC/Co-IP）等研究。该成果为茄科植物功能基因组学研究提供了高效技术平台，发表于《Horticultural Plant Journal》。

　　

辣椒作为全球重要的茄科经济作物，其基因功能研究长期受制于复杂的叶片结构——多层致密的叶肉组织阻碍了传统瞬时表达技术的应用。更棘手的是，现有聚乙烯二醇(PEG)介导的原生质体转化方法效率仅30%左右，且受分子量、DNA用量等变量影响显著。与此同时，跨物种异源表达系统常出现蛋白错误定位，如水稻OsWRKY62在本氏烟中核定位而在水稻胞质聚集，凸显物种特异性研究平台的必要性。

安徽师范大学 Cheng Wei 团队创新性地将农杆菌浸润与原生质体技术结合，避开了PEG转化的技术瓶颈。研究选取六叶期辣椒和本氏烟的第一、二片真叶，通过两种原生质体制备方案：Method I采用刀片切条法，Method II创新性使用胶带剥离下表皮。实验显示Method II原生质体产量达14.70×10⁶·g^-1 FW，活力88.39%，转化效率75.33%，显著优于传统方法。

关键技术包括：1) 农杆菌GV3101介导的叶片浸润（OD₆₀₀=0.8）；2) 含1.25%纤维素酶R10的消化体系；3) 双分子荧光互补(BiFC)和分裂荧光素酶(Split-LUC)互作验证；4) 共免疫沉淀(Co-IP)实验；5) 内质网标记蛋白CD3-959-RFP等亚细胞定位参照。

3.1 辣椒原生质体瞬时表达系统

通过35S::GFP转化验证，Method II在产量、活力和转化效率上全面优于传统切条法。胶带法剥离下表皮使酶解更充分，且避免机械损伤，为后续功能研究奠定基础。

3.2 亚细胞定位分析

系统成功解析了CaLRR51-GFP的质膜定位、CaWRKY01_10-GFP的核定位。特别发现内质网标记CD3-959-RFP与CaP24δ3-GFP共定位，而水稻高尔基体标记OsPHT4;6-2-mCherry在辣椒中异常分布，证实异源标记的局限性。

3.3 蛋白互作研究

通过BiFC观察到CaPti-nYFP与CaCsn-cYFP在内膜系统的互作信号，Split-LUC检测到显著荧光素酶活性（相当于阳性对照CRY2同源互作的90%），Co-IP则从生化层面验证了CaPti-GFP与CaCsn-3HA的结合。

3.4 本氏烟系统优化

因本氏烟下表皮难以剥离，采用Method I获得16.92×10⁶·g^-1 FW原生质体，转化效率达85.57%，证实该方案的普适性。

这项研究突破了PEG转化的技术壁垒，其核心价值体现在三方面：首先，农杆菌浸润结合酶解法将转化效率提升至75%以上，且操作时间缩短50%；其次，为膜蛋白研究提供免质壁分离的技术路径，通过原生质体直接观测到CaLRR51的质膜定位；最后，建立的BiFC/Split-LUC/Co-IP技术体系，为揭示辣椒免疫调控网络（如CaPti-Csn互作）提供方法论支持。

讨论部分特别指出，尽管原生质体不适用于胞外蛋白研究，但其在CRISPR编辑验证（如sgRNA效率测试）、体细胞杂交等育种应用中潜力巨大。作者建议未来可优化培养条件解决辣椒原生质体再生难题，并探索该系统在更多作物中的应用。这项技术将组学数据与功能研究高效衔接，为后基因组时代的植物生物学研究提供了标准化工具。