基于组合优化算法ALLEGRO的真菌界CRISPR向导RNA跨物种设计研究

本研究针对CRISPR-Cas9系统在非模式生物中应用受限的难题，开发了ALLEGRO（Algorithm for a Linear program Enabling Guide RNA Optimization）算法。通过整数线性规划技术，该研究成功设计了靶向2263种真菌转录组的最小化sgRNA文库（仅需9条sgRNA），并在Kluyveromyces marxianus等多物种中验证了编辑效率（90-100%）。这项工作为跨物种基因组编辑提供了通用解决方案，显著推进了比较基因组学和合成生物学研究。

　　

基因组编辑技术CRISPR-Cas9的革命性突破为生命科学研究带来了全新工具，但其应用长期受限于物种特异性设计瓶颈。传统sgRNA设计工具通常仅针对单一物种，面对真菌等高度多样化的生物类群时，研究者不得不为每个物种单独设计向导RNA，这不仅耗时耗力，更阻碍了跨物种比较研究和规模化基因操作。特别是在工业微生物改造、病原真菌研究和进化生物学领域，亟需开发能够覆盖整个生物类群的通用型CRISPR工具。

这项发表于《Nucleic Acids Research》的研究提出了创新性解决方案。研究团队开发了ALLEGRO算法，该技术核心在于将sgRNA设计转化为组合优化问题，利用整数线性编程寻找覆盖多物种基因靶点的最小sgRNA集合。通过设置不同设计轨道（track A_m和E_m）和冗余阈值，系统能智能平衡文库规模与编辑效率。

关键技术方法包括：1）基于DIAMOND的orthogroup分析确定跨物种保守靶点；2）uCRISPR算法预测sgRNA活性；3）Cas9-核糖核蛋白（RNP）递送系统验证跨物种编辑效率；4）利用2263个真菌基因组（来自NCBI、FungiDB等数据库）进行大规模计算验证；5）在Kluyveromyces marxianus等5种酵母中通过原质体转化进行实验验证。

研究结果

1.九条sgRNA覆盖千种子囊菌转录组

配置A₁轨道时，ALLEGRO仅需9条sgRNA即可靶向1000种Ascomycota的全部转录组。如图2所示，首条sgRNA靶向翻译延伸因子TEF2，覆盖92% Sordariomycetes和80% Eurotiomycetes物种。

2.营养缺陷型基因的跨物种靶向

针对CAN1等6个营养缺陷标记基因，E₁轨道设计的文库（1485条sgRNA）相较传统方法减少89%。实验验证显示，在Yarrowia lipolytica中TRP1基因编辑效率达100%，显著优于对照组（图4C）。

3.新型真菌的编辑验证

通过Cas9-RNP系统，将文库成功应用于训练集未包含的Rhodotorula araucariae，FCY1和LYS2基因编辑效率分别达85%和78%（图5B），证实了方法的普适性。

讨论与意义

该研究突破了CRISPR技术在非模式生物中应用的三大障碍：首先，ALLEGRO算法通过数学优化将sgRNA文库规模降低1-2个数量级；其次，建立的通用型Cas9-RNP递送体系克服了物种转化效率差异；最后，交叉验证证实90%测试物种可被预设计文库覆盖，为"设计-验证"模式提供了新范式。

这项工作由加州大学河滨分校的Amirsadra Mohseni和Reyhane Ghorbani Nia等学者合作完成，其创新性体现在：1）首次实现真菌界规模的CRISPR工具设计；2）开发了可调节的轨道系统（track A_m/E_m）满足不同研究需求；3）通过冗余阈值等启发式算法解决超大规模计算难题。这些突破不仅将加速真菌基因组学研究，其方法论更可拓展至植物、动物等真核生物，为合成生物学和精准医学提供跨物种编辑新工具。