解脂耶氏酵母基因组随机胞嘧啶碱基编辑系统开发及β-胡萝卜素生物合成新靶点发现

本研究针对解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)基因组编辑工具匮乏的问题，创新性地开发了Helicase-CDA全基因组随机碱基编辑系统。研究人员通过融合酵母MCM5解旋酶与胞苷脱氨酶(CDA)，实现了连续C-to-T特异性突变，成功筛选到β-胡萝卜素产量提升25%的突变株CDA-14（发酵产量达6.15 g/L）。该研究不仅突破了传统NHEJ依赖的基因组编辑局限，更鉴定出调控甾醇合成的关键膜蛋白YALI1B16239g（MGA2同源物）新靶点，为萜类化合物代谢工程提供了重要工具和理论依据。

　　

在合成生物学和代谢工程领域，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)因其卓越的脂质积累能力和环境耐受性，已成为生产高价值化合物的明星微生物。然而，这种工业微生物的遗传改造仍面临两大技术瓶颈：一是缺乏高效的基因组规模突变工具，传统非 homologous末端连接(NHEJ)方法在工程菌株中效率低下；二是萜类化合物生物合成途径调控网络复杂，难以通过理性设计实现代谢流精准调控。针对这些挑战，中国科学院团队在《Microbial Cell Factories》发表的研究成果，为这一领域带来了突破性进展。

研究团队开发了创新的Helicase-CDA基因组编辑系统，巧妙融合了解脂耶氏酵母MCM5解旋酶(YALI1_A01766g编码)与海洋七鳃鳗来源的胞嘧啶脱氨酶(CDA)。该系统利用DNA复制过程中解旋酶产生的单链区域，实现全基因组范围的C→T定向突变。为验证该系统并挖掘萜类合成新靶点，研究人员首先构建了高产β-胡萝卜素的底盘菌株YL065，通过过表达ERG12、ERG20、IDI等甲羟戊酸途径基因和三个拷贝的CarRP/CarB carotenogenic基因，使产量达到352.79 mg/L。

关键技术包括：1) 构建MCM5-CDA融合蛋白表达系统；2) 7天连续传代培养建立突变文库；3) 基于β-胡萝卜素自发荧光的流式分选(FACS)高通量筛选；4) 全基因组测序鉴定因果突变；5) 通过基因敲除和回补实验验证靶点功能；6) 5L规模补料分批发酵验证工业适用性。

Helicase-CDA系统的构建与验证

研究团队通过生物信息学分析发现，解脂耶氏酵母MCM5与酿酒酵母MCM5具有53%序列相似性，证实其DNA解旋功能保守。构建的pMCM5-CDA质粒在YL065菌株中表达后，经7天连续培养产生的突变株CDA-14表现出显著提升的β-胡萝卜素产量（448.1 mg/L）。全基因组测序显示，CDA-14积累了90个突变，其中C→T转换占比68%，远高于对照组的0%，证实了系统的编辑特异性。

高产突变株的表型分析

通过流式细胞术筛选获得的高产突变株CDA-14，在5L发酵罐中产量达6.15 g/L，较亲本提高31%。有趣的是，该突变株在保持较高生物量的同时，单位细胞干重产量提升至39.28 mg/g DCW，表明代谢流分配得到优化。

关键靶点YALI1_B16239g的功能解析

基因组分析发现CDA-14在YALI1_B16239g基因发生G1637A突变，导致Arg546→Gln替换。该基因编码与酿酒酵母甾醇调控因子MGA2同源的膜蛋白。反向遗传验证显示，敲除该基因使ERG1（角鲨烯环氧化酶）表达降低68%，角鲨烯积累增加65.4%，同时β-胡萝卜素单位产量提升27%。这表明YALI1_B16239g通过调控甾醇合成与类胡萝卜素竞争前体IPP/DMAPP的分配。

代谢调控机制阐释

研究揭示了YALI1_B16239g的罕见密码子突变可能降低其表达水平，进而抑制ERG1转录，减少碳流向甾醇途径。这种调控使更多前体流向β-胡萝卜素合成，同时适度升高的角鲨烯积累（5.6-8.0%）表明代谢网络存在补偿机制。该发现为理解萜类化合物代谢交叉调控提供了新视角。

这项研究具有多重重要意义：技术上，Helicase-CDA系统突破了传统NHEJ编辑对工程菌株的限制，实现了连续基因组进化；应用上，6.15 g/L的β-胡萝卜素产量达到工业级水平；科学上，发现YALI1_B16239g这一全新代谢调控节点，为优化萜类化合物生产提供了新靶点。该成果不仅推动了解脂耶氏酵母遗传工具开发，也为微生物细胞工厂的快速优化提供了普适性策略。