受生物膜启发的脂质纳米颗粒增强了CRISPR-Cas9对A型血友病的编辑效果

《Journal of Contextual Behavioral Science》：Biomembrane-inspired lipid nanoparticles enhance CRISPR-Cas9 editing for hemophilia A

CRISPR-Cas9递送系统通过生物膜启发式脂质纳米颗粒（LNPs）优化实现肝靶向基因编辑，较基准ALC-0315 LNPs编辑效率提升2.3倍。联合AAV递送的Factor VIII供体在血友病A小鼠模型中展现持久（>12周）且安全的基因校正效果，显著优于传统AAV载体，同时避免插入性突变风险。

　　在基因治疗领域，CRISPR-Cas9技术的出现极大地推动了基因编辑的进展，使得科学家能够以高精度的方式修改特定的DNA序列。然而，尽管CRISPR-Cas9在实验室研究中表现出色，其在临床应用中的推广仍受到多种因素的限制。其中，主要的挑战包括：如何实现安全有效的体内递送、如何避免免疫系统的激活、如何确保基因编辑的特异性以及如何实现靶向组织的高效递送。这些问题的存在，使得CRISPR-Cas9在治疗某些疾病时仍然面临一定的障碍。

为了解决这些问题，研究人员正在积极探索新的递送系统，其中脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles, LNPs）因其在RNA治疗中的广泛应用而受到关注。LNPs作为一种非病毒载体，具有良好的生物相容性和较低的毒性，同时具备较高的基因编辑效率。然而，传统的LNPs在某些方面仍存在不足，例如内体逃逸效率较低、靶向性不强以及难以实现长期的基因编辑效果。因此，如何优化LNP的组成和结构，以提高其在体内递送CRISPR-Cas9的效率，成为当前研究的重要方向。

近年来，研究人员通过结合生物膜的特性，设计了一种新型的LNP系统，该系统包含了鞘磷脂（Sphingomyelin, SM）和C18-β-甘露糖基神经酰胺（C18-GalCer）等成分，以改善肝靶向的CRISPR递送效果。这种优化后的LNP系统在体外和体内实验中均表现出较高的编辑效率，相较于传统的ALC-0315 LNP系统，其在肝细胞中的编辑效率提高了2.3倍。此外，该系统还具备良好的稳定性和较低的免疫反应，使得其在长期储存和多次冻融循环后仍能保持其功能特性，为临床转化提供了坚实的基础。

在具体的研究中，研究人员利用了一种双报告基因的肝细胞系，该细胞系可以同时表达绿色荧光蛋白（GFP）和Crimson荧光蛋白，从而实现了对CRISPR递送效果的更精确评估。通过系统性的实验优化，研究人员发现，当调整鞘磷脂与DOPE（二油酰基磷脂酰乙醇胺）的比例时，可以显著提高LNP的内体逃逸效率和靶向性。此外，研究人员还发现，C18-GalCer的加入能够增强LNP与肝细胞受体的结合能力，从而提高基因编辑的效率。

在肝靶向的基因编辑方面，血友病A（Hemophilia A）是一个非常重要的研究对象。血友病A是由F8基因突变引起的遗传性出血性疾病，目前主要依赖于血浆因子VIII的替代治疗。然而，这种治疗方法无法从根本上解决患者的基因缺陷，因此，肝靶向的基因编辑被认为是一种更具前景的治疗策略。研究人员通过结合AAV（腺相关病毒）和LNP两种递送系统，实现了对血友病A模型的高效和持久的基因修复。具体而言，研究人员利用AAV8载体递送一个缺失B域的F8基因片段，并通过LNP递送CRISPR-Cas9系统，使得在体内实验中，血友病A小鼠的血浆因子VIII活性能够恢复到野生型水平的50%以上，并且这种修复效果能够维持超过12周的时间，同时未检测到明显的系统性毒性或脱靶效应。

这一研究的成果表明，基于生物膜的LNP系统不仅能够提高CRISPR-Cas9在体内的递送效率，还能够实现更安全、更持久的基因编辑效果。此外，该系统还具备良好的可重复性和可扩展性，这使得其在未来的临床应用中具有广阔的发展前景。研究人员还指出，与传统的AAV载体相比，基于LNP的系统能够避免长期表达带来的潜在风险，如插入突变和免疫反应，同时还能通过调整剂量实现更精确的治疗效果。

在材料和方法方面，研究人员使用了一系列常见的脂质材料，包括ALC-0315、SM-102、DLin-MC3-DMA、胆固醇、DSPC（二棕榈酰基磷脂酰胆碱）、PEG2000-DMG（聚乙二醇-2000-二甲基甘油醚）等。这些材料均从商业供应商处获得，包括AVT Pharmaceutical Tech和Avanti Polar Lipids等公司。此外，研究人员还使用了其他辅助材料，如柠檬酸和氯化钠，以确保实验的准确性和可重复性。

在伦理方面，本研究的动物实验是在中国天津的国家实验血液学重点实验室（State Key Laboratory of Experimental Hematology, SKLEH）进行的，所有实验均遵循SKLEH机构动物护理与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC）和血液学研究所的伦理审查流程。实验过程中，研究人员确保所有操作符合动物福利的伦理标准，并尽可能减少动物的痛苦和不适。实验结束后，小鼠通过吸入麻醉剂异氟烷（isoflurane）进行安乐死，随后进行颈椎脱臼以确保其彻底死亡。

此外，研究人员还声明了本研究不存在利益冲突。所有作者均未参与任何可能影响研究结果的商业活动或利益关系。这表明本研究的结论具有较高的可信度和客观性。

总的来说，本研究通过设计一种基于生物膜的LNP系统，成功提高了CRISPR-Cas9在肝靶向基因编辑中的效率和安全性。这一成果不仅为血友病A的治疗提供了新的思路，也为其他基因编辑疗法的发展奠定了基础。未来，研究人员将继续优化LNP的组成和结构，以提高其在不同组织和疾病模型中的应用效果，同时探索其在人类临床试验中的可行性。此外，研究人员还计划进一步研究LNP的长期稳定性和安全性，以确保其在实际应用中的可靠性。

在基因治疗的道路上，CRISPR-Cas9技术无疑是一个重要的里程碑。然而，要实现其在临床中的广泛应用，还需要克服一系列技术难题。基于生物膜的LNP系统作为一种新兴的非病毒递送方式，为这些问题的解决提供了新的可能性。通过结合生物膜的天然成分和优化的脂质结构，研究人员成功提高了LNP的内体逃逸效率、靶向性和稳定性，从而实现了更高效的基因编辑效果。这一研究的成果表明，LNP系统在未来的基因治疗中具有广阔的应用前景，尤其是在需要安全、持久和可重复递送的疾病治疗中。

此外，研究人员还强调了LNP系统相较于传统AAV载体的优势。AAV载体虽然在基因治疗中具有较高的转导效率，但其长期表达可能导致潜在的插入突变和免疫反应，这限制了其在某些疾病中的应用。而LNP系统则能够实现短暂的Cas9表达，从而降低了这些风险。同时，LNP系统还具备较高的载药容量，使得其能够携带更复杂的基因编辑工具，如较大的编辑器或供体模板。这为未来的基因编辑疗法提供了更大的灵活性和可能性。

在实验设计方面，研究人员采用了多种优化策略，包括系统性的脂质比例调整、胆固醇含量的优化以及表面配体结构的改进。这些策略的实施，使得研究人员能够更精确地控制LNP的性能，从而提高其在基因编辑中的效率。此外，研究人员还利用了双报告基因的肝细胞系，以更全面地评估LNP的递送效果。这种实验方法不仅提高了研究的准确性，也为未来的基因治疗研究提供了新的思路。

在研究的结论部分，研究人员指出，基于生物膜的LNP系统不仅能够提高CRISPR-Cas9在体内的递送效率，还能够实现更安全、更持久的基因编辑效果。这一系统在长期储存和多次冻融循环后仍能保持其功能特性，为临床转化提供了坚实的基础。此外，研究人员还强调了该系统的可重复性和可扩展性，这使得其在未来的基因治疗研究中具有广阔的应用前景。

综上所述，本研究通过设计一种基于生物膜的LNP系统，成功提高了CRISPR-Cas9在肝靶向基因编辑中的效率和安全性。这一成果不仅为血友病A的治疗提供了新的思路，也为其他基因编辑疗法的发展奠定了基础。未来，研究人员将继续优化LNP的组成和结构，以提高其在不同组织和疾病模型中的应用效果，同时探索其在人类临床试验中的可行性。此外，研究人员还计划进一步研究LNP的长期稳定性和安全性，以确保其在实际应用中的可靠性。