基于RPA-CRISPR/Cas13系统的猪轮状病毒快速灵敏可视化检测技术

本文开发了一种基于CRISPR/Cas13d系统的新型可视化检测平台，整合重组酶聚合酶扩增（RPA）、T7转录和荧光信号输出技术，针对猪轮状病毒（PoRV）VP6基因实现101 copies/μL的高灵敏度检测。该平台操作简便、成本低廉，为资源有限地区的PoRV早期诊断和流行病学调查提供了有力工具。

　　

猪轮状病毒的检测挑战与突破

猪轮状病毒（PoRV）是引发仔猪病毒性肠炎的主要病原体之一，对养猪业和公共卫生构成严重威胁。现有检测方法如RT-qPCR存在操作复杂、设备依赖性强等问题，难以满足基层实验室或现场检测需求。

CRISPR/Cas13d系统的创新应用

研究团队构建了基于CRISPR/Cas13d的检测平台，通过以下技术整合：

1. 1.

   RPA扩增：在37°C恒温条件下30分钟内完成靶标DNA扩增

2. 2.

   T7转录：将DNA转化为RNA以激活Cas13d的侧切活性

3. 3.

   荧光报告系统：采用FAM标记的ssRNA实现信号可视化

系统优化与性能验证

经过多轮优化后：

• •

  最佳crRNA（crRNA2）使荧光强度提升3倍

• •

  EsCas13d与crRNA的1:1比例实现最高检测效率

• •

  灵敏度达10 copies/μL，较常规PCR提升100倍

在62例临床腹泻样本检测中，与RT-qPCR结果完全一致，阳性检出率8.06%，证实其临床可靠性。

技术优势与未来展望

该平台的三大创新点：

1. 1.

   一体化设计：采用"一管法"减少气溶胶污染风险

2. 2.

   便携性：仅需便携式恒温装置和UV灯即可完成检测

3. 3.

   成本效益：单次检测成本不足传统方法的1/5

研究者指出，未来将通过整合逆转录步骤开发RT-RPA联用系统，并拓展至猪流行性腹泻病毒（PEDV）等病原体的多重检测，为动物疫病防控提供更全面的技术支撑。