综述：柔性传感：探索用于无机材料缺陷检测和性能评估的柔性超声技术

《Sensors and Actuators A: Physical》：Flexible sensing: Exploration of flexible ultrasound technology for defect and property evaluation of inorganic materials

检测冠状动脉疾病的关键生物标志物miRNA-33，本研究开发了一种集成滚环扩增（RCA）与CRISPR/Cas12a跨切活性的荧光/比色双模比率平台。通过磁分离纯化后，残留的碱性磷酸酶催化氧化反应，实现荧光（430-558 nm）与颜色（黄变蓝）的双重信号输出，消除背景干扰并提升检测精度。该平台灵敏度达4.6 fM，兼容血清样本，结合机器学习模型可精准识别miRNA-33浓度，为便携式心血管疾病诊断提供新工具。

　　这项研究提出了一种新颖的荧光/比色双模式检测平台，用于超敏感和高特异性检测miRNA-33，这一生物标志物在冠状动脉疾病（CAD）的早期诊断中具有重要价值。通过将滚动环扩增（RCA）技术与CRISPR/Cas12a的转切割活性相结合，并引入机器学习辅助的信号分析，该平台在保持检测准确性的同时，显著提升了灵敏度和实用性。这一创新性的检测方法不仅简化了实验流程，还减少了背景干扰，使得在复杂生物样本中的检测更加可靠。

miRNA-33作为一种重要的调控因子，在多种生理过程中发挥关键作用，尤其是在调控胆固醇稳态、高密度脂蛋白的生物合成、脂肪酸氧化以及胰岛素信号通路方面。然而，miRNA-33的临床转化面临诸多技术挑战，主要由于其分子量小、序列高度同源以及在循环中的丰度较低。这些特性使得传统的检测方法难以实现高灵敏度和高选择性的检测。现有的检测技术，如聚合酶链式反应（PCR）、Northern blotting、电化学传感器和荧光光谱法等，虽然各有优势，但也存在一定的局限性。例如，PCR虽然具有极高的灵敏度，但需要复杂的设备和耗时的程序；而荧光光谱法则容易受到背景噪声和光谱干扰的影响，导致假阳性结果的增加。

鉴于上述问题，开发一种高度敏感、选择性强且易于操作的分析平台对于miRNA的检测，尤其是便携式和现场检测（POCT）应用，显得尤为重要。CRISPR技术因其快速检测、高特异性以及良好的存储稳定性，成为构建新型miRNA检测平台的重要工具。近年来，研究人员利用CRISPR/Cas12a系统开发了多种检测策略，如基于催化发夹组装系统的比色检测方法、结合磁珠和HRP信号元件的信号放大方法，以及基于四面体DNA纳米结构的检测策略等。这些方法在一定程度上提高了检测的灵敏度和准确性，但大多数仍依赖于单一发射荧光信号，容易受到外部因素的干扰，如探针浓度、激发强度和环境温度的变化，从而影响检测结果的可靠性。

为了克服这些局限，研究团队设计了一种基于比色荧光的双模式检测平台。该平台利用了锰氧化物纳米片（MnO? NS）的特殊光学性质。MnO? NS具有可调的表面特性、易于合成、良好的生物相容性和优异的催化性能，使其成为构建比色荧光平台的理想材料。特别值得注意的是，MnO? NS能够高效地氧化非荧光的邻苯二胺（OPD），生成具有荧光特性的2,3-二氨基苯酚（DAP）。在单波长激发下，该系统能够发出两种不同的荧光信号，从而实现比色和荧光信号的同步输出。这种原位生成的双荧光信号不仅简化了实验流程，还显著降低了检测成本。

此外，该系统还表现出明显的颜色变化，从黄色变为蓝色，这使得检测不仅限于荧光信号，还可以通过肉眼观察颜色变化来实现初步筛查。这种双模式信号输出不仅提高了检测的可靠性，还通过信号间的相互校正，增强了定量分析的精度和准确性。相比于传统的比色荧光探针，该方法无需对寡核苷酸进行双有机染料标记，从而避免了复杂的合成过程和高昂的材料成本。此外，与大多数依赖金属纳米颗粒聚集导致颜色变化的双模式平台不同，该系统的颜色变化是通过酶催化反应实现的，从而提高了检测的特异性。

该研究的核心设计是将RCA技术与CRISPR/Cas12a系统的转切割活性相结合。首先，将硫醇修饰的5′端和生物素标记的3′端单链DNA（S-DNA）固定在氨基化的磁珠（MBs）表面。随后，通过生物素-链霉亲和素的相互作用，将链霉亲和素标记的碱性磷酸酶（ALP-SA）连接到磁珠上。当目标miRNA-33存在时，它会与S-DNA发生特异性杂交，从而触发RCA反应。RCA生成的长单链DNA能够激活CRISPR/Cas12a/crRNA复合物的转切割活性，进而切割磁珠表面的生物素标记的S链。经过磁分离后，释放出的ALP催化将2-磷酸三钠盐转化为抗坏血酸（AA），AA与OPD和MnO? NS反应，导致颜色从蓝色变为黄色，同时伴随着荧光信号从430 nm向558 nm的变化。

这种比色荧光的双模式检测方法具有显著的优势。首先，由于荧光物种是在检测过程中原位生成的，因此无需预先设计特定的DNA模板，简化了实验流程。其次，通过机器学习模型（如LASSO线性回归）对荧光信号进行分析，可以更准确地识别miRNA-33的浓度，提高检测的鲁棒性和可靠性。此外，该平台在实际应用中表现出良好的稳定性和抗干扰能力，尤其是在血清样本分析中，能够有效排除复杂基质中的干扰因素，从而实现更精准的检测。

从技术角度来看，这一检测平台结合了多种先进的技术手段。RCA技术能够通过模板DNA的扩增，显著放大目标miRNA-33的信号，从而提高检测的灵敏度。CRISPR/Cas12a系统的转切割活性则能够实现对目标miRNA的高度特异性识别。MnO? NS的引入为检测提供了独特的光学响应，使得比色和荧光信号能够同步输出，提高检测的可靠性。而机器学习的引入则为信号分析提供了新的思路，使得检测结果更加精准和可重复。

在实验方法上，该研究首先制备了MnO? NS。具体而言，将一定浓度的MnCl?·4H?O、TMA·OH和30%的H?O?溶液混合，并通过超声处理和搅拌反应生成MnO? NS。随后，通过离心和洗涤步骤对纳米片进行纯化，确保其表面的清洁度和均匀性。在制备磁珠时，研究团队利用了磁珠与单链DNA之间的交联作用，将DNA固定在磁珠表面，为后续的信号检测和放大奠定了基础。

为了实现信号的放大和检测，研究团队设计了基于RCA和CRISPR/Cas12a系统的检测流程。当目标miRNA-33与磁珠表面的S-DNA发生杂交后，RCA反应被启动，生成大量的单链DNA产物。这些产物能够激活CRISPR/Cas12a/crRNA复合物的转切割活性，从而切割磁珠表面的S链。磁珠表面的S链被切割后，释放出的ALP催化反应，使得OPD和MnO? NS发生氧化还原反应，生成具有荧光特性的DAP，并伴随颜色的变化。这一过程不仅实现了信号的放大，还通过双模式输出增强了检测的可靠性。

在实际应用中，该平台展示了良好的稳定性和抗干扰能力。特别是在血清样本的检测中，由于血清样本的复杂性，传统的检测方法往往受到基质干扰的影响，导致检测结果不准确。而该平台通过双模式信号输出和机器学习辅助分析，有效排除了这些干扰因素，实现了高灵敏度和高特异性的检测。其检测限（LOD）达到了4.6 fM，检测范围为10 fM至1 nM，这在miRNA检测领域具有重要意义。如此高的灵敏度意味着该平台能够检测到极低浓度的miRNA-33，从而为疾病的早期诊断提供了有力的支持。

此外，该平台的双模式设计还具备良好的实用性。通过智能手机进行颜色分析，可以在现场快速筛查目标miRNA-33的存在与否；而荧光信号的定量分析则可以用于实验室中的进一步验证。这种结合现场筛查和实验室验证的双重功能，使得该平台不仅适用于资源有限的环境，还能满足高精度检测的需求。同时，该方法的简便性和低成本，使其在实际应用中具有广泛的推广前景。

综上所述，这项研究提出了一种基于RCA和CRISPR/Cas12a系统的比色荧光双模式检测平台，用于miRNA-33的超敏感和高特异性检测。该平台通过原位生成荧光物种、双模式信号输出以及机器学习辅助分析，有效克服了传统检测方法的局限性，提升了检测的灵敏度和准确性。其在血清样本中的稳定性和抗干扰能力，为心血管疾病的早期诊断提供了新的工具和思路。这一研究不仅推动了miRNA检测技术的发展，也为现场检测和临床应用提供了可行的解决方案。