SALSA：一种基于流式细胞术的单细胞水平抗坏血酸检测新技术及其在免疫代谢研究中的应用

为解决单细胞内抗坏血酸(AA)检测的技术瓶颈，Lee等开发了新型流式检测技术SALSA（Single-cell Ascorbate Level Sensing Assay）。该技术利用DAF-2探针与氧化态AA(DHA)的特异性反应，通过红移荧光信号(SALSARoja)实现高灵敏度检测，成功揭示免疫细胞亚群间AA分布的异质性，为氧化还原生物学和免疫代谢研究提供了重要工具。

　　

在生命科学领域，抗坏血酸（Ascorbate, AA）作为关键抗氧化剂和表观遗传调控因子，其细胞内浓度与免疫功能密切相关。然而传统检测方法如高效液相色谱(HPLC)需细胞裂解，无法反映单细胞水平的异质性；而现有荧光成像技术又受限于通量和可及性。这种技术缺口严重阻碍了AA在免疫细胞分化、感染防御等过程中的机制研究。

针对这一挑战，俄亥俄州立大学团队在《Redox Biology》发表突破性研究，巧妙改造常用一氧化氮(NO)探针4,5-二氨基荧光素(DAF-2)，开发出单细胞抗坏血酸检测技术SALSA。该技术利用TEMPOL将AA氧化为脱氢抗坏血酸(DHA)，后者与DAF-2形成具有独特红移荧光特性的DAF-2-DHA复合物。通过流式细胞术同步检测绿色(SALSA^Verde)和红橙色(SALSA^Roja)通道，其中SALSA^Roja展现出20倍信号背景比，且能有效规避NO干扰。研究团队进一步结合CRISPR筛选和Gulo基因敲除小鼠模型，系统解析了AA在免疫系统中的分布规律与功能。

关键技术包括：1）基于流式细胞术的多参数荧光检测体系；2）CRISPR-Cas9介导的SVCT1/2基因敲除；3）可逆性细胞膜穿孔标准化AA浓度标定；4）HPLC-MS双平台验证；5）多色流式panel分析免疫细胞亚群。

研究结果

Principle and Limitation of Biochemical AA Detection

通过比较传统板式荧光检测与DAF-2探针反应机制，证实OPDA与DAF-2共享二氨基苯结构，后者可与DHA形成DAF-2-DHA复合物。

Development of SALSA

在HEK293T细胞中，10μM DAF-2-DA结合TEMPOL氧化实现最佳信噪比。关键发现是DAF-2-DHA的发射光谱较DAF-2T红移约30nm，这一特性被用于创建双通道检测体系。

Unexpected Emission Spectrum Red-shift

光谱分析显示SALSA^Roja（BB630通道）灵敏度较SALSA^Verde提高10倍。通过链球菌溶血素O(SLO)穿孔加载不同浓度AA，证实信号强度与细胞内AA浓度呈线性相关（R²>0.98）。

SALSA in NO-producing Cells

在LPS/IFNγ刺激的Raw264.7巨噬细胞中，即使存在大量NO干扰，SALSA^Roja仍能区分生理浓度AA（6.7倍差异）。联合iNOS抑制剂1400W和NO清除剂PTIO可进一步提升特异性。

CRISPR Screening with SALSA

通过抗体条形码混合策略，发现SVCT2（而非SVCT1）是HEK293T细胞主要AA转运体，与人类蛋白质图谱中SLC23A2基因表达量150倍于SLC23A1的结果一致。

Immune Cell Heterogeneity

在Gulo^-/-小鼠模型中，B细胞和髓系细胞AA水平显著高于T细胞。胸腺细胞分析揭示发育阶段与AA含量呈负相关：双阴性(DN)>双阳性(DP)>单阳性(SP)，其中CD25⁺调节性T细胞前体表现出特殊AA需求模式。

结论与意义

该研究通过巧妙的探针重定位策略，将DAF-2从NO检测工具转化为AA特异性传感器。SALSA技术的核心优势在于：①单细胞分辨率揭示传统方法无法检测的AA异质性；②可兼容多色流式panel实现免疫分型；③适用于CRISPR筛选等功能基因组学研究。在应用层面，研究首次发现CD8⁺T细胞具有独特的AA保留能力，而胸腺发育过程中AA的梯度分布提示其可能参与T细胞命运决定。

这项技术突破为营养免疫学、氧化应激研究开辟了新途径。未来或可开发基于免疫细胞AA谱的疾病标志物，类似糖化血红蛋白之于糖尿病管理。作者特别指出，SALSA检测的是"功能性AA池"，比波动较大的血浆AA浓度更能反映机体真实营养状态。随着更多研究的开展，这一技术有望在慢性炎症、肿瘤免疫治疗等领域发挥重要作用。