基于PCR-CRISPR/Cas12a系统的大西洋鲑加工食品灵敏可视化检测技术

为解决大西洋鲑（Salmo salar）在加工食品中易被低价鱼类（如虹鳟鱼）掺假的问题，研究人员开发了一种基于PCR-CRISPR/Cas12a的检测方法。该研究通过靶向线粒体ATP6基因设计gRNA，实现了0.5 pg绝对灵敏度和0.1%相对灵敏度的检测，结果可通过紫外光直接可视化判读。该方法为高价值水产品的真伪鉴别提供了高效工具，发表于《LWT》。

　　

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大西洋鲑作为全球年产量超270万吨的高端水产品，其市场价值与健康属性使其成为食品掺假的重灾区。常见的欺诈手段包括用虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）、粉红鲑（O. gorbuscha）等外观相似但价格低廉的鱼类进行替换，这不仅损害消费者权益，还可能因替代物种携带寄生虫而引发食品安全风险。传统形态学鉴定对加工食品失效，而ELISA等蛋白检测方法无法耐受高温处理。虽然DNA条形码和qPCR等技术具有可靠性，但前者耗时、后者依赖精密仪器。在此背景下，亟需开发兼具高特异性、操作简便且适用于现场检测的新方法。

研究人员从中国、澳大利亚等6国采集19份大西洋鲑样本，通过线粒体基因组测序验证物种真实性后，开发了整合PCR扩增与CRISPR/Cas12a切割活性的检测体系。关键技术包括：1）基于磁珠法的DNA提取技术；2）靶向ATP6基因的gRNA设计及体外转录；3）优化Cas12a/gRNA摩尔比（1:4）和反应条件；4）采用FAM-BHQ1荧光报告系统实现裸眼判读。

3.1 工作原理

该体系通过PCR扩增大西洋鲑特异的ATP6基因片段，激活Cas12a的反式切割活性，使ssDNA报告分子释放荧光信号。实验证实仅当Cas12a、gRNA、靶DNA和报告分子共存时才能产生显著荧光，验证了系统特异性。

3.2 系统优化

在ND1、ND2等5个候选基因中，ATP6基因的gRNA5表现出最高信噪比（S/B=6.02）。优化显示Cas12a与报告分子最佳比例为1:2，反应30分钟即可完成检测，延长至40分钟无显著增益。

3.3 特异性验证

测试11种鱼类（包括6种鲑科鱼类）均无交叉反应，仅大西洋鲑产生荧光信号。相较于既往仅关注虹鳟鱼掺假的研究，本方法覆盖更广的潜在替代物种。

3.4 灵敏度分析

绝对灵敏度达0.5 pg DNA，相当于单拷贝线粒体基因检测能力。在鳕鱼基质中，裸眼可识别1%掺假，荧光检测器可降至0.1%。值得注意的是，高浓度DNA（>50 pg/μL）会抑制PCR效率，提示需优化模板量。

3.5 实际样本检测

在20种市售产品（含7种加工食品）中检出7例阳性，与Sanger测序结果100%一致。发现1例标注"三文鱼香肠"实为猪肉（Sus scrofa）的严重掺假案例，总体误标率达5%。

该研究创新性地将CRISPR/Cas12a的基因编辑特性转化为食品真伪鉴别工具，其核心优势在于：1）突破传统PCR依赖电泳或探针的局限，通过Cas12a的"分子开关"特性实现信号放大；2）线粒体ATP6基因靶点设计兼顾保守性与特异性；3）裸眼判读功能使其适用于基层监管。相比同类技术，该方法灵敏度较CRISPR侧流层析法（5%）提升50倍，较LAMP法（0.46 ng）提高近千倍。未来可通过微流控芯片整合实现全自动化检测，为打击水产品欺诈提供强有力的技术支撑。