CRISPR/Cas9联合流式分选技术高效编辑猫疱疹病毒1型基因组及其在疫苗开发中的应用

本文推荐一种创新性策略：通过CRISPR/Cas9基因编辑系统与荧光激活细胞分选（FACS）技术联用，实现了猫疱疹病毒1型（FHV-1）基因组的高效重组。研究针对病毒胸苷激酶（tk）和糖蛋白E（gE）基因位点，分别插入mCherry和GFP荧光报告基因，将重组病毒构建周期从传统方法的3-4周缩短至数天，为疱疹病毒疫苗开发和功能基因组学研究提供了高效技术平台。

　　

引言

猫疱疹病毒1型（FHV-1）作为α疱疹病毒亚科成员，是全球猫科动物病毒性上呼吸道疾病和眼部病变的主要病原体。其134 kb的双链DNA基因组包含高GC含量（约60%），传统同源重组方法效率低下，需耗时3-4周进行噬斑纯化。尽管细菌人工染色体（BAC）技术曾改进大基因组病毒编辑，但仍面临克隆不稳定和转染效率低等问题。

材料与方法

研究采用猫肾上皮细胞（CRFK）培养FHV-1 GD19毒株。设计靶向tk和gI/gE基因的双sgRNA（如TK-sgRNA-1: 5’-AGACTACGCCAGTATAGCAT-3’），克隆至pX330载体表达化脓链球菌Cas9。通过重叠PCR构建含mCherry/GFP报告基因的供体质粒，使用Lipofectamine 3000转染后以MOI=0.01感染病毒。关键创新在于利用FACS分选荧光阳性细胞，经两轮富集后通过低熔点琼脂糖噬斑纯化获得重组病毒。

结果与讨论

实验成功构建FHV-1-ΔTK-mCherry和FHV-1-ΔgE/ΔgI-GFP重组病毒，效率分别达40.27%±1.253和52.43%±2.430，显著高于传统噬斑法（p<0.0001）。荧光显微镜显示重组病毒稳定表达报告基因，且双sgRNA策略通过诱导双链断裂（DSB）有效促进同源重组（HDR）。值得注意的是，研究团队发现此前在伪狂犬病毒（PRV）中有效的基因组提取策略对FHV-1适用性有限，推测可能与病毒粒子结构差异有关。

该技术平台具有三重应用价值：1）快速构建减毒疫苗候选株，如通过敲除tk等毒力基因；2）高通量研究潜伏感染相关基因；3）可拓展至非洲猪瘟病毒（ASFV）等复杂基因组病毒研究。未来可通过"荧光标记-反向筛选"策略实现无痕编辑，进一步优化FHV-1基因组操作流程。

技术优势解析

CRISPR/Cas9系统通过sgRNA精确定位靶基因（如UL23/US7-US8区域），其核酸酶活性产生DSB后，病毒利用宿主修复机制整合外源序列。FACS则突破传统技术瓶颈：1）单次分选即可获得>40%重组体，较噬斑法提升两个数量级；2）保持荧光报告基因稳定性，避免BAC系统在^{E. coli}中的基因丢失风险。这种"基因剪刀+分子筛"的组合策略为大型DNA病毒研究建立了标准化操作范式。