单步标记技术：通过同步递送试剂实现高效位点特异性整合的通用基因组编辑方法

研究人员开发了名为ONE-STEP tagging的新型基因组编辑技术，通过结合CRISPR-Cas9靶向和Bxb1整合酶介导的位点特异性整合，在hiPSCs、癌细胞和原代T细胞中实现了高效精确的蛋白质标记。该方法通过增强eeBxb1整合酶的核定位信号和共递送DNA-PK抑制剂，在ACTR10位点达到90%整合效率，并能同时进行多重标记和CRISPR编辑，为基因治疗和基础研究提供了强大工具。

　　

在基因组编辑领域，精确高效地实现大片段DNA的位点特异性整合一直是重大挑战。传统方法如同源定向修复（HDR）存在插入片段大小受限、效率低下等问题，而非同源末端连接（NHEJ）则缺乏方向控制且易产生随机整合。这些技术瓶颈严重制约了基因治疗和基础研究的进展，特别是在需要多重基因编辑或大片段插入的应用场景中。

Wellcome Sanger Institute的研究团队在《Nucleic Acids Research》发表了突破性解决方案。他们开发的ONE-STEP tagging技术巧妙地将CRISPR-Cas9的靶向能力与Bxb1整合酶的特异性相结合，通过单步递送实现高效基因组编辑。该技术不仅能插入长达14.4 kb的大片段，还能同步完成基因敲除（KO）等复杂编辑，为细胞治疗和功能基因组学研究开辟了新途径。

研究采用了几项关键技术：1）优化Bxb1整合酶的核定位信号（NLS）和催化活性变体eeBxb1；2）使用DNA-PK抑制剂（如AZD-7648）提高HDR效率；3）开发双attP/attB异源重组系统实现多重标记；4）在hiPSCs、K562细胞和原代T细胞等多种细胞类型中验证技术普适性；5）通过流式细胞术、ddPCR和长读长测序等方法精确评估编辑效率。

【ONE-STEP tagging结合CRISPR-Cas9编辑与Bxb1位点特异性整合】

研究人员设计了一套整合系统，通过CRISPR-Cas9介导的HDR将attP位点插入基因组，随后由Bxb1整合酶催化attB位点供体的定向整合。在hiPSCs中靶向ACTR10基因N端时，通过增加供体浓度可使效率提升至10%。

【通过增强Bxb1的核定位和催化活性提高标记效率】

添加双分选核质蛋白（2xNPL）NLS使野生型Bxb1效率翻倍，而工程化eeBxb1变体结合2xNPL NLS后效率达25%，证实酶活性和核定位共同决定整合效率。

【AZD-7648作为强效DNA-PK抑制剂提高hiPSCs中的基因标记】

四种DNA-PK抑制剂比较显示，0.5 μM AZD-7648处理使ACTR10位点整合效率从25%提升至90%，且在所有Bxb1变体中均观察到增强效果，证明抑制NHEJ通路可显著促进HDR介导的编辑。

【ONE-STEP tagging实现大片段整合】

14.4 kb报告基因构建体在hiPSCs中实现16.6%的整合效率，远超eePASSIGE（1%）和传统HDR方法，证实该系统对大片段插入的独特优势。靶向测序显示99%整合事件准确无误。

【多重ONE-STEP标记】

利用attP/attB-GA和attP/attB-GT正交系统，在hiPSCs中同时标记ACTR10（mNeonGreen）和MAP4（mCherry），双阳性细胞达26%，荧光显微成像确认了蛋白质的正确亚细胞定位。

【ONE-STEP tagging与同步CRISPR编辑】

在BFP报告hiPSC系中，MAP4-mCherry标记与BFP-GFP转换（HDR）同步效率达80%，ACTR10-mNeonGreen与BFP敲除（KO）同步效率达90%，证明该系统支持复杂的多重基因组工程。

【原代T细胞中TRAC位点的靶向整合】

优化电转条件后，在TRAC位点实现12%的4.4 kb eGFP构建体整合，90%的eGFP阳性细胞同时完成B2M敲除，为通用型CAR-T细胞制备提供了单步解决方案。

【双attP/attB盒式ONE-STEP标记】

开发通用供体质粒系统，使用200 nt ssODN和双异源attP位点（GA/GT），在ACTR10位点保持60%效率，并通过Addgene共享质粒资源，大幅提升技术可及性。

这项研究建立了基因组编辑的新范式。ONE-STEP tagging技术通过模块化设计解决了大片段整合、多重编辑和临床应用等关键问题。其在hiPSCs中高达90%的效率和14.4 kb的承载能力，为疾病建模和基因治疗提供了前所未有的工具。特别值得注意的是，该技术在原代T细胞中的成功应用，使TRAC位点CAR插入与免疫逃避基因（如B2M）敲除能够同步完成，这将显著简化"通用型"CAR-T细胞的制备流程。研究人员还通过开发双attP/attB盒式系统和共享质粒资源，确保了技术的可扩展性和普适性。随着进一步优化，这项技术有望成为基础研究和临床应用的黄金标准。