光遗传学操控内源性RhoGEF揭示上皮组织皱褶形成的生物物理机制

本研究通过CRISPR/Cas9技术构建了果蝇内源性RhoGEF2和Cysts/Dp114RhoGEF的光遗传学工具OptoRhoGEFs，解决了传统转基因工具表达量变异大、影响胚胎发育的问题。研究人员利用定量光遗传学扰动技术，揭示了RhoGEF招募剂量与组织皱褶深度的关系，发现基底肌动球蛋白网络对皱褶取向和尺寸的调控作用。该研究为理解发育过程中组织形态发生的力学机制提供了新范式。

　　

在胚胎发育过程中，上皮组织如同可塑的薄片，通过复杂的重塑过程塑造胚胎形态。然而，科学家们一直困惑于：为什么不同发育环境会采用不同的皱褶形成机制？这些机制如何精确控制组织三维形态？传统转基因光遗传学工具因表达量变异和过度表达干扰，难以定量研究这些问题。

哥伦比亚大学生物工程系的研究团队在《Nature Communications》发表重要成果。他们创新性地采用CRISPR/Cas9技术，将光敏异源二聚体iLID/SspB系统精准标记到果蝇内源性RhoGEF2和Cysts基因上，开发出OptoGEF2和OptoCysts工具。通过定量光遗传学扰动技术，结合双光子激活和三维成像，揭示了上皮组织形态发生的力学原理。

关键技术包括：1) CRISPR/Cas9介导的内源性基因标记；2) 双光子光遗传学定量激活系统；3) 活体胚胎三维实时成像；4) 基底膜激光消融力学检测；5) 组织形变定量分析。这些技术实现了对Rho信号通路的精确时空调控和力学响应定量测量。

内源性OptoRhoGEFs的开发与表征

研究人员将SspB肽段标记到RhoGEF2和Cysts的内源位点，构建了四种可存活品系。与表达催化结构域的转基因工具相比，内源性工具显示更稳定的表达水平和更低的发育干扰。双光子激活实验表明，侧向激活诱导细胞顶端-基底缩短，形成浅皱褶。

RhoGEF驱动的细胞缩短具有剂量依赖性

通过建立定量激活管道，发现皱褶深度与激活剂量呈线性关系。OptoCysts的活性比OptoGEF2低0.29倍，这与两者蛋白水平比0.40相符。这种剂量依赖性表明发育过程中可通过调节RhoGEF膜锚定位点数量来精确控制形态。

大范围侧向激活导致组织弯曲而非皱褶

当激活区域直径超过50μm时，组织出现外向弯曲而非内向皱褶。这种弯曲行为不符合起皱或屈曲理论预测，而是源于基底层的机械约束。椭圆激活实验证实，组织弯曲方向受胚胎固有曲率调控。

扰动基底力学改变组织皱褶行为

在scra RNAi背景下，基底肌动球蛋白网络被破坏后，皱褶方向发生反转，且大范围激活不再引起弯曲。激光消融显示scra RNAi胚胎基底张力降低62%，证实基底力学特性对皱褶取向的关键作用。

内源性OptoRhoGEFs的广泛应用

研究还展示了该工具在细胞化、羊浆膜收缩、背闭合等多个发育阶段的适用性。单细胞激活可诱导局部收缩，而全组织激活能可逆地改变胚胎形态，证实了工具的多功能性。

这项研究首次实现了对内源性RhoGEFs的精确光控，建立了定量研究组织力学的范式。发现基底力学层作为"形态检查点"的核心作用，解释了不同发育环境选择不同皱褶机制的生物物理基础。Andrew D. Countryman等开发的OptoRhoGEFs不仅解决了转基因工具的局限性，更为发育力学研究提供了普适性方法，对理解器官发生和再生医学中的形态构建具有深远意义。