基于CRISPR-Cas9技术解析水牛乳腺上皮细胞中MFGE8基因在泌乳调控中的关键作用及蛋白质组学特征

本研究通过CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建MFGE8基因敲除的水牛乳腺上皮细胞(BuMEC)模型，结合定量蛋白质组学技术系统解析了乳脂球表皮生长因子8(MFGE8)在泌乳生物学中的调控机制。研究发现MFGE8缺失导致细胞形态改变、增殖减缓，并影响FABP3/4/5等乳脂合成相关基因表达，为理解乳腺发育和乳汁分泌的分子机制提供了新见解。论文发表于《Scientific Reports》。

　　

在哺乳动物泌乳生物学领域，乳脂球表皮生长因子8(MFGE8/Lactadherin)一直是个充满谜题的多功能蛋白。这个最初在乳腺上皮中发现的糖蛋白，不仅参与乳腺组织重塑，还在免疫调节、细胞凋亡清除等过程中扮演关键角色。更引人注目的是，前期研究发现MFGE8的表达水平与奶牛产奶量呈正相关，这使其成为研究高产奶量分子机制的理想靶点。然而，MFGE8究竟如何调控泌乳过程？其分子机制至今尚未完全阐明。

为了破解这一科学难题，印度国家乳业研究所的研究人员开展了一项创新性研究。他们选择水牛乳腺上皮细胞(BuMEC)作为模型，采用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建MFGE8敲除细胞系，并结合iTRAQ定量蛋白质组学技术，系统分析了MFGE8缺失对细胞功能及蛋白质表达谱的影响。这项研究成果发表在《Scientific Reports》上，为理解乳腺发育和乳汁分泌的分子机制提供了重要线索。

研究人员主要运用了三大关键技术：首先采用CRISPR-Cas9系统设计三种gRNA靶向MFGE8基因的第二、三外显子，通过质粒转染和嘌呤霉素筛选获得稳定敲除细胞系；其次利用NGS扩增子测序验证基因编辑效率，显示gRNA3在第二外显子PAM位点上游3-4bp处产生54%的indels；最后通过iTRAQ标记结合LC-MS/MS技术对敲除细胞进行全蛋白质组分析，鉴定出4282个蛋白质。

研究结果部分，"Successful generation of CRISPR/cas9 mediated MFGE8 knockout BuMEC"显示，gRNA3转染的细胞MFGE8表达降低最显著，Western blot验证蛋白水平几乎消失。编辑细胞呈现形态扭曲、增殖减缓特征，MTT和BrDU实验证实细胞活力下降40-50%。

"Proteome analysis by mass spectrometry"部分揭示，mfge8-/-/gRNA3细胞中有178个差异表达蛋白(DEPs)，其中124个上调(如FABP4/5、APOA1/2)、54个下调(如FABP3、SERPINH1)。这些蛋白主要定位在细胞膜(21.41%)、细胞质(18.48%)和细胞核(15.95%)。

"Functional classification annotation analysis"部分通过GO分析发现，DEPs显著富集于水解酶活性调控、内肽酶活性、细胞骨架组织等通路。特别值得注意的是，多个与乳脂合成相关的基因(FABP3/4/5、KNG1、MT2A等)表达发生显著改变。

在讨论部分，研究揭示了几个重要发现：MFGE8缺失导致细胞骨架蛋白(如ARPC5L、ACTA2)表达异常，这与先前发现的MFGE8参与细胞极化和乳脂滴运输功能一致；脂代谢相关基因呈现复杂变化模式——FABP4/5上调可能补偿MFGE8缺失，而FABP3下调则可能影响PPARγ/SREBP1信号通路；特别重要的是，研究首次发现MFGE8可能通过调控TG水解酶活性影响乳脂分泌，这为理解乳腺脂代谢提供了新视角。

这项研究的创新性在于首次建立了MFGE8完全敲除的水牛乳腺上皮细胞模型，并绘制了相应的全蛋白质组图谱。不仅证实了MFGE8对乳腺上皮细胞形态和增殖的关键作用，更发现了其对乳脂合成相关基因网络的广泛调控。这些发现为改良乳畜生产性能提供了潜在分子靶点，也为进一步研究MFGE8在乳腺生理病理过程中的作用机制奠定了基础。未来研究可结合激素处理模拟泌乳周期，更全面揭示MFGE8在乳腺发育不同阶段的动态功能。