综述：利用CRISPR-Cas系统开发即时诊断应用

这篇综述系统阐述了CRISPR-Cas系统在分子诊断领域的革命性应用，重点探讨了如何克服样本处理、试剂稳定性和成本效益等关键挑战，以推动其向符合WHO的ASSURED标准（快速、灵敏、设备简化）的即时检测（POC）和家庭诊断转化。文章深入分析了CRISPR-dx技术在非核酸靶标检测、冻干保存（lyophilization）和多重检测（multiplexing）等方面的最新突破。

　　

CRISPR诊断技术的突破与挑战

Abstract

CRISPR系统通过其基因编辑能力彻底改变了生命科学领域，而Cas12/Cas13等酶的转切割（trans-cleavage）特性进一步推动了分子诊断技术的发展。这类技术具备速度快、特异性强、可编程和多重检测等优势，但在转化为商业化即时诊断产品时仍面临样本前处理、试剂稳定性和成本控制的瓶颈。

Introduction

早期疾病检测依赖核酸测试（NAT），但传统PCR技术对设备和人员要求高，等温扩增技术又易产生非特异性信号。世界卫生组织提出的ASSURED标准（经济、灵敏、特异、易用、快速、免设备、可及）为诊断技术发展指明方向。CRISPR系统凭借其天然核酸识别机制，尤其是Class II型Cas12（靶向DNA）和Cas13（靶向RNA）的转切割活性，成为满足这些标准的理想候选。

Amplification-free CRISPR-based diagnostics

部分Cas效应物可在皮摩尔（picomolar）浓度下直接检测基因组DNA、miRNA和mRNA，避免了核酸预扩增导致的误差。例如，Cas13通过设计特定crRNA实现了对SARS-CoV-2 RNA的高灵敏度检测，而Cas12被用于癌症突变位点的识别。

Limitations of CRISPR-based diagnostics

尽管SHERLOCK等技术已获批临床应用，但冷链运输（cold-chain）和试剂稳定性仍是POC推广的主要障碍。此外，复杂样本（如全血）的前处理步骤尚未完全简化。

Lyophilization

冻干技术可解决酶和crRNA的常温保存问题。研究表明，添加海藻糖等保护剂能显著提升冻干Cas蛋白的活性保留率，使其在40°C下稳定储存超过30天。

Expansion for non-nucleic acid targets

通过结合适配体（aptamer）或抗体，CRISPR系统已拓展至小分子、蛋白质和外泌体检测。例如，将ATP适配体与crRNA串联，使得Cas12能间接检测ATP浓度。

Outlook

未来需整合微流控（microfluidics）和智能手机读值技术，实现“样本-结果”全流程自动化。随着冻干工艺和信号放大方法的优化，CRISPR诊断有望成为资源有限地区的游戏规则改变者。