基于多模块CRISPR生物机器的β-葡糖基转移酶活性超灵敏检测技术

（编辑推荐）本研究创新性地构建了整合5-hmC糖基化触发回文引物超支化滚环扩增（PP-HRCA）的多模块CRISPR生物机器，通过β-GT催化保护模块、CRISPR/Cas介导切割模块的级联反应，实现了2.75×10?6 U/mL检测限的β-葡糖基转移酶（β-GT）超灵敏分析，为表观遗传研究和噬菌体-宿主互作机制探索提供了新工具。

　　

亮点

我们开发了一种结构有序的多模块CRISPR生物机器，通过整合5-hmC糖基化触发的回文引物超支化滚环扩增（PP-HRCA），实现了外源性β-葡糖基转移酶（β-GT）活性的超灵敏分析。

实验方法

β-GT催化活性检测

酶反应体系（10 μL）包含梯度浓度β-GT、100 nM哑铃探针、120 μM UDP-葡萄糖和1×NEBuffer 4，37°C孵育2小时后加入10 U MspI内切酶继续消化1小时。

多模块CRISPR生物机器的作用机制

该生物机器包含三大功能模块：

1. 1.

   β-GT催化保护模块：5-hmC糖基化修饰可保护哑铃探针免受MspI切割；

2. 2.

   回文引物扩增模块：完整哑铃探针触发PP-HRCA，产生大量串联双链DNA；

3. 3.

   CRISPR切割模块：扩增产物激活Cas12a对信号探针的反式切割，释放Cy5荧光分子。

结论

这种融合糖基化保护（β-GT）、指数级扩增（PP-HRCA）和CRISPR信号放大（Cas12a）的生物机器，能以2.75×10^?6 U/mL的检测限实现β-GT超灵敏分析，为表观遗传修饰研究和酶抑制剂筛选提供了创新平台。