基于CRISPRi表观遗传调控的单载体系统治疗面肩肱型肌营养不良症的研究

本研究针对面肩肱型肌营养不良症(FSHD)中DUX4-fl基因的异常表达问题，开发了基于CRISPR抑制(CRISPRi)技术的单载体表观遗传调控系统。研究人员通过优化肌肉特异性启动子HLH和最小化表观抑制因子（如MeCP2 TRD），成功构建了符合AAV载体容量限制的全合一(AIO)治疗系统，在FSHD1/2型肌细胞和异种移植小鼠模型中实现了DUX4-fl的有效抑制，为FSHD基因治疗提供了具有临床转化潜力的新策略。

　　

面肩肱型肌营养不良症(FSHD)作为第三大常见的肌营养不良症，困扰着全球患者却缺乏有效治疗手段。这种疾病的罪魁祸首是4q35染色体上D4Z4大卫星重复序列的表观遗传调控失常，导致本应在成体细胞中沉默的DUX4基因在骨骼肌中异常表达。DUX4作为胚胎发育早期的先锋转录因子，其在成体肌肉中的异位表达会激活胚胎基因程序，引发肌肉退化。更棘手的是，FSHD存在两种亚型：占多数的FSHD1型由D4Z4阵列收缩引起，而FSHD2型则由表观沉默维持蛋白（如SMCHD1）突变导致，但最终都殊途同归地引起DUX4的病理表达。

美国内华达大学雷诺医学院药理学系（University of Nevada, Reno School of Medicine）的Charis L. Himeda团队在《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》发表的研究，针对这一医学难题开发了创新的基因治疗策略。与既往尝试通过CRISPR编辑删除DUX4多聚腺苷酸化信号(PAS)的方法不同，该团队另辟蹊径采用CRISPR抑制(CRISPRi)技术，通过表观遗传调控实现DUX4的长期沉默。这种策略不仅避免了基因组切割带来的潜在风险，更符合FSHD作为"功能获得性"疾病的治疗逻辑。

研究团队运用了三大关键技术：1）优化肌肉特异性启动子HLH（Have a Little Heart），使其在骨骼肌高效表达同时保持心脏低活性；2）最小化表观抑制因子（如将HP1α/γ缩减至仅含CSD和CTE结构域）；3）构建符合AAV载体4.4kb容量限制的全合一(AIO)治疗系统。实验采用FSHD患者来源的肌细胞（17Abic、MB073等）和异种移植小鼠模型进行评估。

【设计用于DUX4-fl表观遗传抑制的AIO CRISPRi平台】部分显示，研究团队将dSaCas9与五种最小化抑制因子（MeCP2 TRD、HP1α/γ CSD&CTE、SUV39H1 SET结构域、KRAB TRD）融合，配合靶向DUX4启动子/外显子1的sgRNA，成功构建了系列AIO载体。

直观展示了该平台的进化历程。

【使用最小化表观抑制因子的AIO CRISPRi载体抑制FSHD1肌细胞中DUX4-fl】部分证实，在原发性FSHD1肌细胞中，TRD-DUX4和HP1α/γ-DUX4均能使DUX4-fl表达降低约50%，且对肌肉分化标志物MYH1无影响。值得注意的是，虽然KRAB-DUX4能抑制DUX4-fl，却未能降低其靶基因表达，提示不同抑制因子的作用机制存在差异。

显示单载体系统使sgRNA表达提高5倍，为抑制效果提供保障。

【双载体和单载体CRISPRi系统抑制FSHD2肌细胞中DUX4-fl】部分首次证实该平台对FSHD2型同样有效，TRD-DUX4使DUX4-fl降低70%，靶基因抑制达80-85%，效果优于FSHD1型，可能与细胞基线表达水平差异相关。

【AIO CRISPRi系统在FSHD异种移植小鼠模型中抑制DUX4-fl】部分通过系统性注射MyoAAV2A.TRD-DUX4，在人类源化小鼠模型中实现DUX4-fl抑制40-80%。

显示尽管存在转导不均问题，治疗效果仍显著。

这项研究通过精巧的分子工程设计，解决了AAV载体容量限制与CRISPRi组件复杂性之间的矛盾。特别是HLH启动子的优化和MeCP2 TRD的应用，在保证组织特异性的同时实现了高效抑制。虽然DNA甲基化分析显示4周时尚未检测到D4Z4甲基化改变，但考虑到AAV在肌肉中的长期持久性，这种基于表观调控的策略仍具临床潜力。该工作不仅为FSHD治疗提供了新思路，其模块化设计更为其他肌肉疾病的基因治疗提供了可借鉴的技术平台。