微流控辅助体外区室化实现CRISPR-Cas活性的无细胞高通量筛选

本研究针对传统CRISPR-Cas系统筛选方法的局限性，开发了基于微流控双乳液（DE）的无细胞转录翻译（TXTL）平台。研究人员通过单步生成单分散DE液滴，结合荧光激活分选（FACS）技术，成功将CRISPR活性与报告基因表达关联，并利用磁珠固定基因实现基因型-表型关联。该技术为CRISPR系统的高通量工程化提供了新思路，发表于《TRENDS in Biotechnology》。

　　

CRISPR-Cas系统作为原核生物的适应性免疫机制，已被改造为强大的基因组编辑工具。然而，传统筛选方法依赖体内选择策略，存在细胞毒性、通量低等问题。如何实现CRISPR效应蛋白（如Cas9、Cas12）和向导RNA（gRNA）的高效筛选，成为领域内亟待突破的技术瓶颈。

荷兰瓦赫宁根大学（Wageningen University）的研究团队在《TRENDS in Biotechnology》发表创新性研究，将微流控技术与无细胞表达系统相结合，建立了基于双乳液（DE）的高通量筛选平台。通过单步生成单分散DE液滴，研究人员成功封装了包含CRISPR组分和报告基因的转录翻译（TXTL）体系，并开发了两种遗传电路：一种通过CRISPR靶向抑制绿色荧光蛋白（deGFP）表达，另一种通过抑制阻遏蛋白cl间接增强荧光信号。实验证明，SpCas9、ThermoCas9和Cas12f1三种核酸酶在DE中均能有效切割靶标，其中SpRYCas9对非经典PAM（YAC）的识别能力显著优于野生型SpCas9。通过荧光激活分选（FACS）分选混合DE群体后，靶向gRNA基因型在低荧光群体中富集达4.3倍。为强化基因型-表型关联，团队还开发了基于磁珠的区室化基因扩增技术，使单个液滴内基因拷贝数提升至100-150个，显著增强信号差异。

关键技术包括：1）PDMS微流控芯片制备与DE生成；2）基于σ⁷⁰启动子的无细胞表达系统构建；3）双荧光报告电路设计；4）sdDE-FACS分选技术优化；5）磁珠固定化基因扩增。

CRISPR-Cas活性在DE中的验证

通过封装SpCas9与靶向P70a_deGFP的gRNA，DE内荧光强度降低1.8-4倍，与微孔板实验结果趋势一致。

非经典PAM识别能力比较

SpRYCas9对YAC-PAM靶点的切割效率比野生型SpCas9高10-15倍，DE内荧光差异达1.8倍（P<0.001）。

基因型富集与表型关联

FACS分选后，靶向gRNA在低荧光群体中富集4.3倍，测序验证了基因型-表型关联性。

磁珠固定化基因扩增

区室化PCR扩增使磁珠携带100-150个基因拷贝，显著提升信号强度差异（P<0.001）。

该研究首次将微流控DE技术与无细胞CRISPR筛选相结合，突破了传统方法的通量限制。单液滴体积仅皮升级，每小时可生成>10⁶个DE，较96孔板效率提升万倍。技术亮点在于：1）通过DE实现反应体积微型化；2）利用商业FACS设备完成超高通量筛选；3）磁珠固定技术避免复杂微流控操作。尽管目前受限于效应蛋白尺寸（如Cas12f1更适合该平台），但为微型CRISPR系统优化和gRNA库筛选提供了新范式。未来通过标准化“即插即用”模块开发，有望推动该技术在基因治疗工具开发中的广泛应用。