计算引导的大肠杆菌基因组重构及其在纳米聚对苯二甲酸乙二醇酯生物降解与升级回收中的应用

本研究针对大肠杆菌无法天然降解聚乙烯对苯二甲酸酯(PET)的难题，开发了GenRewire基因组重构技术。研究人员通过CRISPR/Cas9编辑和计算引导的蛋白质工程，成功将大肠杆菌内源蛋白LsrB和SsuA改造为人工PET水解酶，实现了无需外源DNA的纳米PET降解(37°C下5.15μmol/h/mg)，并进一步通过代谢工程使菌株能将PET降解产物转化为高附加值化学品原儿茶酸(PCA)。该技术为塑料生物降解提供了创新解决方案，同时减少了对外源基因的依赖。

　　

塑料污染已成为全球性环境挑战，其中聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)作为最常见的合成聚合物之一，其降解问题尤为突出。虽然自然界存在某些能降解PET的微生物，但其效率有限且机制复杂。更棘手的是，工业主力菌株如大肠杆菌(Escherichia coli)缺乏天然的PET降解能力，传统方法依赖外源基因导入往往导致代谢负担和遗传不稳定性。如何在不引入外源DNA的前提下，赋予模式微生物高效PET降解能力，成为合成生物学和代谢工程领域亟待突破的科学难题。

来自西班牙国家研究委员会催化与石油化学研究所(Instituto de Catalisis y Petroleoquimica, ICP-CSIC)和巴塞罗那超级计算中心(Barcelona Supercomputing Center, BSC)的研究团队在《TRENDS IN Biotechnology》发表创新成果。他们开发了名为GenRewire的基因组重构技术，通过计算引导的蛋白质工程结合CRISPR/Cas9编辑，成功将大肠杆菌BL21(DE3)改造为能降解纳米PET并实现产物升级回收的细胞工厂。这项研究不仅提供了塑料生物降解的新范式，还展示了内源蛋白质功能重编程的巨大潜力。

研究团队采用了多学科交叉的技术路线：1) 通过AlphaFold 2.0和PELE(Protein Energy Landscape Exploration)蒙特卡洛算法预测蛋白质结构与底物结合位点；2) 使用分子动力学模拟评估人工催化三联体(Ser-His-Asp)的稳定性；3) CRISPR/Cas9介导的基因组编辑实现内源基因替换；4) HPLC和质谱分析降解产物；5) 原子力显微镜(AFM)表征纳米PET粒径分布。

计算与实验结合的基因组重构流程

研究团队首先对大肠杆菌BL21(DE3)基因组进行系统性分析，从4,156个蛋白质中筛选出386个潜在靶标。通过PELE全局探索模块，他们发现转运蛋白LsrB和硫结合蛋白SsuA具有容纳PET寡聚物的结构特征。经过精确的催化三联体设计，获得的LsrBm变体(G318S/D317H/S287D)对PET纳米颗粒(nPET)的降解活性达到5.15μmol/h/mg(37°C)，接近天然PET水解酶LCC-ICCG的40%活性。

内源蛋白的理性设计与功能验证

晶体结构分析显示，改造后的LsrBm保持了天然构象，其工程化活性中心与底物ETETETE的结合自由能达-39.95 kcal/mol。分子动力学模拟证实，人工催化三联体在>35%的模拟时间内保持催化距离(<3.5?)。实验验证发现，LsrBm在60°C对PET粉末(pPET)的降解活性提升至19.62μmol/h/mg，且不干扰其天然的AI-2信号转导功能。

基因组编辑菌株的构建与表征

通过CRISPR/Cas9将lsrBm基因整合至大肠杆菌基因组，获得的S1菌株在含nPET的培养基中表现出独特生长曲线：6小时内nPET悬浊液透明度显著增加，伴随7263±215μM降解产物的积累。重要的是，基因组重构未影响菌株适应性，在LB和M9培养基中的生长速率与野生型差异<5%。

与天然降解菌的性能比较

研究选取了五种天然PET降解菌(包括Stutzerimonas stutzeri和Halopseudomonas属菌株)作为对照。在相同条件下(28°C,24h)，这些菌株仅产生18-94μM降解产物，而基因组重构的大肠杆菌S1菌株降解效率提高1-2个数量级，证明计算引导设计的有效性。

代谢通路扩展与产物升级

通过引入来自Comamonas thiooxidans的tphA2A3BA1基因簇，工程菌株S1PCA实现了从PET到原儿茶酸(PCA)的级联转化。在20小时培养中，PCA产量达4501±45μM，同时菌体生物量(OD_600nm)增长至0.75±0.01，展示了闭环生物制造的潜力。

这项研究开创性地证明，通过计算引导的基因组重构可以突破天然代谢网络的限制。GenRewire技术的核心价值在于：1) 避免外源基因导入带来的代谢负担；2) 保持内源蛋白的天然功能；3) 实现复杂生物催化系统的快速构建(2-3个月)。特别值得注意的是，研究者通过"盲测"验证了设计可靠性——故意引入的非活性变异体均未显示降解活性，反证了计算预测的准确性。该工作为塑料废弃物的生物转化提供了新思路，其方法论也可扩展到其他难降解聚合物的生物处理领域。未来，通过优化蛋白质分泌系统和表面展示策略，有望将当前纳米PET降解能力扩展到宏观PET材料的工业化处理。