基于CRISPR的矩阵调控技术：酿酒酵母中多基因组合调控的"即插即调"新方法

本研究针对酿酒酵母代谢工程中多基因表达调控的难题，开发了名为Matrix Regulation(MR)的CRISPR组合调控技术。研究人员通过构建混合tRNA-gRNA阵列、优化dSpCas9-NG的PAM识别范围、增强VPR激活域活性，实现了对甲羟戊酸途径和血红素合成途径中8个基因的68种组合调控，最终使角鲨烯和血红素产量分别提升37倍和17倍。该技术为复杂代谢途径优化提供了高效工具。

　　

在代谢工程领域，精确调控多个基因的表达水平一直是重大挑战。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为重要的细胞工厂，其代谢途径中关键酶的表达失衡会导致中间产物积累或资源浪费。传统方法需要通过多轮"设计-构建-测试"循环来优化基因表达比例，过程繁琐且耗时。特别是在缺乏高通量筛选方法的场景下，长代谢途径的精细调控更显困难。

北京化工大学的研究团队在《Nature Communications》发表研究，开发了名为Matrix Regulation(MR)的革命性技术。这项研究通过三大创新突破：混合tRNA-gRNA阵列实现6⁸种组合构建、dSpCas9-NG扩展NG PAM识别范围、以及通过定向进化获得增强3倍的e13711-VPR激活域，建立了完整的"即插即调"系统。研究人员将该技术应用于甲羟戊酸(MVA)途径和血红素合成途径的优化，仅通过随机挑选50个转化子就使角鲨烯产量提升37倍，500个转化子筛选使血红素产量提高17倍。

关键技术包括：(1)筛选7种tRNA构建混合gRNA阵列实现组合调控；(2)验证dSpCas9-NG在酵母中对NG PAM的调控效率；(3)从101个候选激活域中筛选并通过三轮定向进化获得e13711-VPR突变体；(4)设计双向调控gRNA实现基因表达上调和抑制；(5)建立不依赖表型的随机筛选策略。

混合tRNA阵列实现组合调控

研究首先筛选了tRNA^Leu、tRNA^Gln等7种tRNA，验证其在5-gRNA阵列中的加工效率。通过ADE2报告系统证实这些tRNA具有相当的RNA剪接效率，为后续构建6⁸组合库奠定基础。

dSpCas9-NG扩展靶向范围

比较dCas9、dxCas9和dSpCas9-NG三种变体对16种NG PAM的调控能力，发现dSpCas9-NG-VPR能有效识别所有NG PAM，解决了AT富集启动子区域靶位点受限的问题。

增强型VPR激活域开发

通过易错PCR和三轮FACS筛选，从1.5×10⁸个细胞中获得e13711突变体，使mCherry表达提升15.5倍，Zeocin抗性从100 mg/L提高到600 mg/L，创造了酵母CRISPR激活效率的新纪录。

MVA途径精细调控

对ERG10、HMG1等8个基因设计位置特异性gRNA，随机挑选50个转化子中有一半显示角鲨烯产量提升4-37倍。转录组分析发现高产菌株均采用HMG1的gRNA4，证实HMG-CoA还原酶是关键限速酶。代谢物检测显示MVA-PP(甲羟戊酸-5-焦磷酸)积累显著，提示ERG19酶活性可能成为进一步优化靶点。

双向调控优化血红素合成

设计激活型和抑制型gRNA建立双向调控系统，筛选500个转化子发现产量差异达152倍。转录分析显示HEM2表达模式与产量高度相关，其下调会导致其他基因过表达失效，证实其在途径中的核心地位。

这项研究建立的MR技术体系，通过模块化设计解决了多基因组合调控的三大瓶颈：文库构建效率、靶向范围限制和调控幅度不足。该技术不仅适用于代谢工程领域，也为研究基因型-表型关系提供了新工具。特别是对缺乏高通量筛选方法的产物，MR仅需随机挑选少量转化子即可获得显著产量提升，展现出强大的应用潜力。研究揭示的途径限速步骤(如HMG1和HEM2)和代谢瓶颈(如MVA-PP积累)也为后续研究提供了重要线索。这种"即插即调"的策略有望成为复杂代谢网络优化的新范式。