CRISPR/Cas9谱系追踪技术在猪胚胎中的建立与应用：推动异种移植与发育生物学研究

为解决猪细胞谱系追踪技术缺失的难题，西南民族大学畜牧兽医学院团队开发了基于CRISPR/Cas9和单细胞转录组（scRNA-seq）的高分辨率分子记录系统。该研究通过piggyBac转座子整合DNA条形码，结合Rosa26位点稳定表达的Cas9-EGFP，成功构建了可捕获细胞分化轨迹的进化谱系记录器，为猪细胞命运图谱绘制及异种移植优化提供了关键技术工具。

　　

在生物医学研究中，猪因其与人类相似的解剖结构和生理特征，成为疾病模型和异种移植的理想对象。然而，追踪猪细胞发育起源、重建谱系关系始终面临技术瓶颈——传统荧光标记和病毒条形码等方法难以满足复杂谱系解析需求。这一困境严重制约了猪器官人源化改造和发育机制研究。

西南民族大学畜牧兽医学院的研究团队在《Molecular and Cellular Probes》发表突破性成果。他们创新性地将CRISPR/Cas9基因编辑与单细胞测序技术结合，开发出适用于猪胚胎的谱系追踪系统。该系统包含两大核心组件：通过piggyBac转座子随机整合的DNA条形码（含3个Cas9靶点和8bp的intBC），以及利用CRISPR/Cas12a精准插入Rosa26安全港位点的Cas9-EGFP持续表达元件。当Cas9在发育过程中持续产生可遗传的indel突变时，这些突变与单细胞转录组数据结合，便能构建细胞演化树。

关键技术包括：1）Cas12a介导的Rosa26位点基因敲入；2）piggyBac转座子递送40种intBC条形码库；3）体外转录制备crRNA和mRNA；4）猪受精卵显微注射；5）10x单细胞测序解析indel多样性。

【研究结果】

2.1 猪同源重组供体载体制备

成功构建含961bp左臂和1009bp右臂的靶向载体，经酶切验证获得10.6kb的pRosa26插入模板。

2.2 分子记录器构建

设计含三个gRNA表达盒（mU6/hU6/bU6启动）的274bp靶点阵列，通过PB转座子与tdTomato共表达，酶切获得6.1kb有效片段库。

2.3 体外转录

优化crRNA、PB和Cas12a的体外转录流程，获得高纯度5'端加帽及polyA尾修饰的mRNA。

2.4 Cas12a/crRNA在猪受精卵中的传递

显微注射后，胚胎存活且持续表达EGFP/tdTomato双荧光。测序显示三个靶位点（ade2/bam3/whiteB）产生不均匀分布的indel，证实该系统能记录细胞分裂过程中的突变积累。

【结论与意义】

该研究首创了直接作用于猪细胞的体外谱系追踪技术，其优势在于：1）多gRNA持续记录时空信息；2）分散靶点降低相邻序列缺失风险；3）多模块可替换设计增强扩展性。通过关联indel模式与细胞状态，该技术不仅能解析猪胚胎发育的细胞起源，更为后续构建人源化器官的基因编辑猪模型奠定基础——例如通过敲除SIX1/SALL1等关键基因制造器官"空缺"，再注入人多能干细胞（PSCs）形成嵌合胚胎。尽管算法差异和空间多组学整合仍是挑战，这项技术为异种移植器官优化和大型哺乳动物发育生物学研究提供了全新工具。