VGRCOT：基于RPA与CRISPR/Cas12a的单管可视化检测技术助力B族链球菌（GBS）围产期感染防控

本研究创新性开发了VGRCOT检测技术，通过将重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR/Cas12a系统整合于单管（one-tube）中，实现B族链球菌（GBS）的60分钟快速可视化检测，灵敏度达101拷贝/反应。该技术通过EP管底盖分区设计避免气溶胶污染，无需复杂仪器即可肉眼判读，为生殖健康领域的床旁检测（POCT）提供了新方案。

　　

ABSTRACT

B族链球菌（GBS）是威胁孕产妇和新生儿健康的重要病原体，本研究开发的VGRCOT技术通过整合RPA扩增与CRISPR/Cas12a系统，在单管中实现GBS核酸可视化检测。优化ssDNA-FQ报告探针（1 μM）、crRNA浓度（1 μM）及反应时间（RPA 20分钟+CRISPR/Cas12a切割40分钟）后，该方法可在紫外灯下肉眼观察荧光，检测限低至10¹拷贝/反应。临床样本验证显示其与qPCR一致性达97.9%，兼具高特异性和操作便捷性。

INTRODUCTION

GBS作为围产期感染的主要致病菌，现行培养法耗时2-3天，免疫检测灵敏度不足，而qPCR依赖昂贵设备。CRISPR/Cas12a系统的trans切割活性可非特异性降解ssDNA探针，结合RPA等温扩增技术可提升检测灵敏度。但传统两步法存在气溶胶污染风险，VGRCOT通过EP管底盖分区设计实现"扩增-检测"一体化。

MATERIALS AND METHODS

以GBS的cfb基因为靶标，设计crRNA识别含TTTN PAM序列的区段。RPA扩增产物经离心与管盖预装的CRISPR/Cas12a系统混合后，激活的Cas12a切割ssDNA-FQ探针（5'-FAM-TTATT-3'-BHQ1）产生荧光信号。采用热裂解法处理临床样本，对比VGRCOT与qPCR（Ct值18-34）的检测效能。

RESULTS AND DISCUSSION

原理验证：crRNA引导的Cas12a仅对GBS靶序列产生特异性切割，阴性对照无荧光信号（Fig. 2）。

参数优化：1 μM crRNA与ssDNA探针组合的信噪比最佳，40分钟切割时间可实现信号饱和（Fig. 3）。

性能评估：能区分GBS与大肠杆菌等4种对照菌（Fig. 4a-c），低浓度检测变异系数仅8%（Table S2）。

临床验证：100例生殖道样本中检出48例阳性，1例假阴性可能源于低载量样本（Ct>30）的探针背景荧光干扰（Fig. 5）。

技术优势与局限

单管设计通过物理隔离RPA与CRISPR反应，较传统两步法污染风险降低83%（文献15数据）。但管盖液体转移需精细操作，未来可结合微流控技术实现全封闭检测。编辑性crRNA使该平台可拓展至HPV、淋球菌等病原体筛查。

应用前景

作为符合ASSURED原则（价廉、灵敏、特异、便捷）的POCT工具，VGRCOT特别适用于基层医疗机构。研究获四川省科技厅（2025ZNSFSC1561）和德阳市重点研发项目（2024SZY001）支持，为《预防围产期GBS感染指南》的筛查方案提供了新选择。